TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 195-202 195 BẢO QUẢN LẠNH TẾ BÀO TRỨNG BÒ GIAI OẠN TÚI MẦM BẰNG PHƯƠNG PHÁP THỦY TINH HÓA TRONG CỌNG RẠ VÀ VI GIỌT Nguyễn Thị Thương Huyền 1, 2 , Lâm Sơn Bích Trâm 3 , Nguyễn Quốc ạt 4 , Hoàng Ngha Sơn 5 , Phan Kim Ngọc 1 1 ại học Khoa học tự nhiên tp. Hồ Chí Minh, * thuonghuyen78@yahoo.com 2 Trường ại học Sư phạm tp. Hồ Chí Minh 3 Bệnh viện Phụ sản Hùng Vương tp. Hồ Chí Minh 4 Viện Chn nuôi Quốc gia 5 Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam TÓM TẮT: ề tài tiến hành nhằm đánh giá việc nuôi chín in vitro và tạo phôi bằng k thuật thụ tinh trong ống nghiệm (TTTON) từ nguồn tế bào trứng (TBT) bò giai đoạn túi mầm (GV) sau khi được bảo quản lạnh bằng phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ và trong vi giọt. Chọn các TBT có từ 3 lớp cumulus trở lên và đồng nhất về tế bào chất đem bảo quản lạnh qua 2 bước: TBT được cân bằng trong dung dịch cân bằng 45 giây, chuyển qua dung dịch thủy tinh hóa 25 giây, sau cùng nạp các TBT vào cọng rạ hoặc tạo các vi giọt, chuyển các cọng rạ và vi giọt chứa TBT vào bình nitơ lỏng trong vòng 30 giây. Giải đông TBT qua 3 bước: môi trường rã đông thứ nhất trong 1,5 phút, môi trường rã đông thứ hai khoảng 1,5 phút và môi trường rã đông thứ ba trong 5 phút. Quá trình giải đông tiến hành ở 25-28 o C. Ðánh giá tỷ lệ sống chết theo quan sát hình thái, sau đó một số được đánh giá theo phương pháp nhuộm AO/PI, số còn lại được nuôi chín in vitro trong môi trường 1 và 2 ở 38,5 o C, 5% CO 2 trong 20-24 giờ. Chọn các TBT chín đem TTTON. Kết quả xét theo thứ tự từ nguồn cọng rạ và vi giọt lần lượt như sau: tỷ lệ sống theo hình thái đạt 68,52±1,19% và 73,53±1,17% (p<0,05), tỷ lệ sống theo phương pháp nhuộm AO/PI đạt 52,69±3,66% và 48,33±3,72% (p>0,05), tỷ lệ chín đạt 20,79±1,38% v à 12,79±1,13% (p<0,05); tỷ lệ thụ tinh (phôi 2 tế bào) đạt 15,64±2,72% và 12,61±3,15%; chỉ có 2/28 phôi phát triển đến giai đoạn phôi nang (từ cọng rạ) . Từ khóa: Bảo quản lạnh, giai đoạn túi mầm, tế bào trứng chín, thụ tinh trong ống nghiệm. MỞ ẦU Kỹ thuật bảo quản lạnh tế bào trứng (TBT) thường gặp khó khn do sự hình thành tinh thể đá, điều này có thể khắc phục được phần nào khi sử dụng phương pháp thủy tinh hóa với tốc độ làm lạnh cực nhanh [9]. ông lạnh TBT chín thường gây tổn thương thoi vô sắc của TBT và kết quả là đứt gãy nhiễm sắc thể, vi ống, vi mao. iều này hạn chế khả nng sống và phát triển của TBT sau giải đông. Ngược lại, ở TBT giai đoạn túi mầm (TBT GV) chưa có tổ chức thoi vô sắc tham gia vào quá trình giảm phân, vì vậy, bảo quản lạnh TBT ở giai đoạn này là một giải pháp thay thế. Tuy nhiên, tỷ lệ chín khi nuôi cấy từ nguồn TBT GV sau đông lạnh chưa cao [4, 9, 12]. Bên cạnh đó, vật mang cng đóng vai trò quan trọng trong kết quả đông lạnh. Có nhiều nghiên cứu trước đây đã thành công khi sử dụng cọng rạ làm vật mang, nhưng sử dụng vi giọt chỉ mới có ít nghiên cứu được công bố [7, 9, 13]. Nghiên cứu này được tiến hành nhằm đánh giá khả nng nuôi chín in vitro và tạo phôi bằng k thuật thụ tinh trong ống nghiệm (TTTON) từ nguồn TBT GV sau khi bảo lạnh bằng phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ và vi giọt. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu TCM-199 (M3769, Sigma), FBS (Gibco), FCS (Gibco), DMSO (Sigma), EG (Sigma), AO/PI (Sigma), dầu khoáng (Merck), Natri pyruvate (Sigma). Thu nhận tế bào trứng TBT được thu nhận bằng phương pháp chọc hút từ các nang có đường kính từ 3-8 mm bằng đầu kim 18G. Các TBT có từ 3 lớp tế bào cumulus dày bao quanh, gọi là TBT giai đoạn túi mầm (TBT GV) được chọn để bảo quản lạnh. ông lạnh và giải đông ông lạnh bằng cọng rạ