SÜGAVKÜLMUTATUD/SULATATUD SPERMIDE KVALITEEDINÄITAJATE SEOS SESOONSUSE JA SUGUPULLI VANUSE NING EMASLOOMADE TIINESTUMISEGA Peeter Padrik a,b* , Triin Hallap b ,Tanel Bulitko a , Ülle Jaakma b a Eesti Tõuloomakasvatajate Ühistu, 79005 Keava, Eesti b Sigimisbioloogia osakond, Veterinaarmeditsiini ja Loomakasvatuse Instituut, Eesti Maaülikool, Kreutzwaldi 62, 51014 Tartu, Eesti *tel.+3727313466; fax +3727313706; e-mail: peeter.padrik@mail.ee ABSTRACT. Influence of bull age and season to fro- zen-thawed semen quality and fertility. The aim of the current study was to investigate the influence of season and bull age to sperm motility, membrane integrity, membrane lipid architecture status and mitochondrial membrane potential characteristics in frozen-thawed (FT) semen, collected from Estonian Holstein (EHF) bulls. Forty five ejaculates from 15 (1–7 years) EHF bulls were examined for motility (objectively using a computer assisted motility analyzer (CMA)), hypo- osmotic swelling (HOS), membrane lipid architecture status (Merocyanine 540 staining) and mitochondrial membrane potential (Mitotracker Deep Reed 633 stain- ing). Stained spermatozoa were assessed by FCM (flow cytometry). The results of the study showed that the in- crease in bulls' age from 1–2 years to 5–7 years was accompanied by the increase in general motility (GMot), membrane stability (LSM) and mitochondrial activity (MTDR-H)(P<0.05), curve line velocity (VCL; P<0.01), linearity (LIN) and amplitude of lateral head displacement (ALH; P<0.001) on batch level. The qual- ity of spermatozoa in FT samples varied between the seasons. The mean values for VCL, ALH and MTDR-H were higher in winter and autumn on both batch and bull level (P<0.05). In relationship with NRR (non- return rate 60-day), strongest correlation was obtained for the ALH results on bull level (P<0.001). We con- clude that the bulls' age and season of semen collection have an effect on sperm quality parameters. Fro- zen/thawed sperm motility parameters, LSM and MTDR-H are related to NRR of cows and heifers and could be used for the prediction of bull's fertility. Key words: Bull, Sperm quality, Age, Season, Fertility Sissejuhatus Piimatootmise efektiivsus ei sõltu ainult väärtusliku geneetilise materjali olemasolust, vaid ka paljudest teis- test faktoritest, mille hulgas on tähtsal kohal lehmade optimaalne poegimisvahemik. Lehmade edukat tiines- tamist pärast poegimist mõjutab oluliselt sügavkülmuta- tud pullisperma kvaliteet. Sügavkülmutatud pullisperma kvaliteeti mõjutavad omakorda mitmed tegurid nagu aastaaeg, millal sperma varuti (Mandal et al., 2003; Padrik, Jaakma 2004; Koivisto et al., 2009), sugupulli vanus (Pant et al., 2003; Hallap et al., 2004; Helbig et al., 2007) jt. Samuti on selgunud et, mida rohkem on kvaliteedinäitajaid sügavkülmutatud/sulatatud spermide kohta, seda täpsemalt võib nende põhjal prognoosida spermide viljastamisvõimet (Rodriguez-Martinez, 2006; Rodriguez-Martinez and Barth, 2007). Kuigi paljud seemendusjaamade laborid on juba varustatud uuemate spermide funktsionaalsete omaduste hindamise tehno- loogiatega nagu liikuvuse kompuuteranalüüs (CASA), mis muudab labori töö oluliselt efektiivsemaks ja objek- tiivsemaks, jääb ainult selle kasutamine siiski ühekülg- seks, sest põhineb vaid spermide liikumisomadustel, samuti on hinnatavate spermide arv väike (ca 500 rak- ku). Uute, suurema jõudlusega meetodite juurutamine nõuab aga kõigepealt seniste, juba kasutusel olevate meetodite võrdlust uutega. Vajalik on testida uute mee- todite sobivust nii seemendusjaama igapäevatöösse kui ka nende perspektiivikust emasloomade tiinestumise prognoosimisel. Paljud autorid on oma uuringutes näidanud voolu- tsütomeetria efektiivsust ja täpsust spermide kvaliteedi hindamisel (Hallap et al., 2006; Kasimanickam et al., 2006; Peña et al., 2007). Selle tehnoloogia puhul hinna- takse ühe analüüsiga keskmiselt 10000 rakku kiirusega 200 rakku/s. Kui spermide liikuvuse hindamine CASA abil annab objektiivse ülevaate nii värske kui ka sügav- külmutatud/sulatatud sperma kvaliteedist (Muiño et al., 2008) ning selle tulemused korreleeruvad hästi emas- loomade tiinestumisega (Januskauskas et al., 2003), siis voolutsütomeetriliseks analoog-testiks spermide funkt- sionaalsuse hindamiseks oleks spermi keskosas asuvate mitokondrite membraanipotentsiaali (MMP) määrami- ne. Kõrge MMP viitab intensiivsele energia tootmisele, mida spermatosoid vajab edasiliikumiseks teel viljas- tuspaika (Vishwanath et al., 1986; Hua et al., 2006; Wu et al., 2006). Hallap et al. (2005) täheldas oma uurimis- töös, et spermide mitokondriaalse aktiivsuse määramine MitoTracker Deep Red 633 ja voolutsütomeetri abil oli igati sobilik spermide liikumisvõime kaudseks hindami- seks kuna korreleerus hästi CASA tulemustega. Spermimembraani funktsionaalse terviklikkuse hin- damiseks on mitmeid võimalusi: traditsiooniline hüpo- osmootne test (Jeyendran et al., 1984), selle modifikat- sioonid (Padrik, 1999; Petrunkina et al., 2001; Amorim et al., 2009), spermide värvimine fluorestseeruvate ke- mikaalidega (Brito et al., 2003) jne. Sügavkülmuta- tud/sulatatud spermide membraanide terviklikkuse kõr- val on mebraani stabiilsus oluliseks kvaliteedinäitajaks spermide funktsionaalsuse hindamisel (Hallap et al., 2005). Selle määramise üheks võimaluseks on kasutada Merocyanine 540 (M540) värvingut ja voolutsüto- meetriat, mis võimaldab kindlaks teha, kui suurel mää- ral on toimunud fosfolipiidide ümberpaigutumine