Human GLUD1 and GLUD2 glutamate dehydrogenase localize to mitochondria and endoplasmic reticulum Vasileios Mastorodemos, Dimitra Kotzamani, Ioannis Zaganas, Giovanna Arianoglou, Helen Latsoudis, and Andreas Plaitakis Abstract: Mammalian glutamate dehydrogenase (GDH), an enzyme central to glutamate metabolism, is thought to localize to the mitochondrial matrix, although there are also suggestions for the extramitochondrial presence of this protein. Whereas GDH in mammals is encoded by the GLUD1 gene, humans and the great apes have, in addition, a GLUD2 gene showing a distinct expression pattern. The encoded hGDH1 and hGDH2 isoenzymes are highly homologous, but their leader sequences are more divergent. To explore their subcellular targeting, we constructed expression vectors in which hGDH1 or hGDH2 was fused with the enhanced green fluorescent protein (EGFP) and used these to transfect COS 7, HeLa, CHO, HEK293, or neuroblastoma SHSY-5Y cells. Confocal microscopy revealed GDH-EGFP fluorescence in the cytoplasm within coarse structures. Cotransfection experiments using organelle-specific markers revealed that hGDH1 or hGDH2 colocalized with the mitochondrial marker DsRed2-Mito and to a lesser extent with the endoplasmic reticulum marker DsRed2-ER. Western blots detected two GDH-EGFP specific bands: a ~90 kDa band and a ~95 kDa band associ- ated with the mitochondria and the endoplasmic reticulum containing cytosol, respectively. Deletion of the signal se- quence, while altering drastically the fluoresce distribution within the cell, prevented GDH from entering the mitochondria, with the ~90 kDa band being retained in the cytosol. In addition, the deletion eliminated the ~95 kDa band from cell lysates, thus confirming that it represents the full-length GDH. Hence, while most of the hGDHs translocate into the mitochondria (a process associated with cleavage of the signal sequence), part of the protein localizes to the endoplas- mic reticulum, probably serving additional functions. Key words: glutamate dehydrogenase, leader peptide deletion, subcellular localization, EGFP. Re ´sume ´: La glutamate de ´shydroge ´nase de mammife `re (GDH), une enzyme centrale du me ´tabolisme du glutamate, est pre ´sume ´e e ˆtre localise ´e dans la matrice mitochondriale me ˆme si sa pre ´sence hors de la mitochondrie a aussi e ´te ´ sugge ´re ´e. La GDH chez les mammife `res est code ´e par le ge `ne GLUD1, mais les humains et les grands singes posse `dent en plus le ge `ne GLUD2 montrant un patron d’expression distinct. Les isoenzymes hGDH1 et hGDH2 sont hautement homologues mais leurs se ´quences de te ˆte sont plus divergentes. Afin d’explorer leur ciblage subcellulaire, nous avons construit des vec- teurs d’expression dans lesquels hGDH1 ou hGDH2 sont fusionne ´es a ` la prote ´ine fluorescente EGFP, et nous les avons uti- lise ´s pour transfecter des cellules COS 7, HeLa, CHO, HEK293 ou les neuroblastomes SHSY-5Y. La microscopie confocale a re ´ve ´le ´ la pre ´sence de la fluorescence de la GDH-EGFP dans le cytoplasme, a ` l’inte ´rieur de structures grossie `- res. Des expe ´riences de co-transfection avec des marqueurs spe ´cifiques d’organelles ont montre ´ que hGDH1 ou hGDH2 sont co-localise ´es avec le marqueur mitochondrial DsRed2-Mito et, a ` un degre ´ moindre, avec le marqueur du re ´ticulum en- doplasmique DsRed2-ER. L’immunobuvardage a permis de de ´tecter deux bandes spe ´cifiques de GDH-EGFP : une bande de ~90 kDa associe ´e a ` la mitochondrie et une bande de ~95 kDa pre ´sente dans le cytosol comprenant le re ´ticulum endo- plasmique. La de ´le ´tion de la se ´quence signal, en modifiant la distribution cellulaire de la fluorescence de fac ¸on importante, empe ˆchait la GDH d’entrer dans la mitochondrie, la bande de ~90 kDa e ´tant retenue dans le cytosol. En plus, la de ´le ´tion a e ´limine ´ la bande de ~95 kDa des lysats cellulaires, confirmant ainsi qu’elle correspondait a ` la GDH de pleine longueur. Ainsi, alors que les hGDH sont majoritairement transloque ´es dans la mitochondrie (un processus associe ´ au clivage de la se ´quence signal), une partie des prote ´ines se localisent dans le re ´ticulum endoplasmique, jouant probablement d’autres ro ˆles. Mots-cle ´s : glutamate de ´shydroge ´nase, de ´le ´tion du peptide de te ˆte, localisation sub-cellulaire, EGFP. [Traduit par la Re ´daction] Received 1 December 2008. Revision received 4 March 2009. Accepted 6 March 2009. Published on the NRC Research Press Web site at bcb.nrc.ca on 6 May 2009. V. Mastorodemos, 1 D. Kotzamani, 1 I. Zaganas, G. Arianoglou, H. Latsoudis, and A. Plaitakis. 2 Department of Neurology, School of Health Sciences, Faculty of Medicine, University of Crete, Heraklion, Crete 71003, Greece. 1 These authors contributed equally to this work. 2 Corresponding author (e-mail: plaitak@med.uoc.gr). 505 Biochem. Cell Biol. 87: 505–516 (2009) doi:10.1139/O09-008 Published by NRC Research Press