Internationale Ausgabe: DOI: 10.1002/anie.201701038 Protonierungszustand Deutsche Ausgabe: DOI: 10.1002/ange.201701038 Ladungen verschieben Protonierungen: Neutronenbeugung zeigt, dass Anilin und 2-Aminopyridin protoniert an Trypsin binden Johannes Schiebel, Roberto Gaspari, Anna Sandner, Khang Ngo, Hans-Dieter Gerber, Andrea Cavalli, Andreas Ostermann, Andreas Heine und Gerhard Klebe* Abstract: Wasserstoffatome sind entscheidend bei der Ver- mittlung von Protein-Ligand-Wechselwirkungen. Sie bestim- men die Qualität entstehender H-Brückennetzwerke und de- finieren Protonierungszustände gebundener Liganden. Die strukturelle Visualisierung von H-Atomen ist rçntgenkristal- lographisch nur selten mçglich. Hier wurden die Wasserstoff- positionen von Anilin und 2-Aminopyridin im an die Serin- protease Trypsin gebundenen Zustand durch Neutronenbeu- gung untersucht. Die resultierenden Strukturen wurden mit der hçchsten bisher für Proteine mit > 100 Aminosäuren erzielten Auflçsung erhalten. Dies ermçglicht die exakte Beschreibung der Protonierungszustände und Wechselwirkungen mit umge- benden Wassermolekülen. Trotz seines niedrigen pK a -Werts von 4.6 und einem Abstand von 3.6  zum geladenen Asp189 am Boden der S1-Tasche liegt die Aminogruppe von Anilin protoniert vor. Hingegen wird in 2-Aminopyridin das Pyridin- N-Atom protoniert, obwohl dessen Aminogruppe um 1.6  näher an Asp189 liegt. Folglich ist, abgesehen von Ladungs- Ladungs-Abständen, die Stabilität der mçglichen Tautomere ausschlaggebend für den erhaltenen Bindungsmodus und damit entscheidend für die Vorhersage von Bindungsmodi. Wasserstoffbrücken spielen eine entscheidende Rolle bei der selektiven Liganderkennung durch Biomakromoleküle. [1] Leider ist die Erfassung und Visualisierung von präzisen Wasserstoffpositionen in Protein-Ligand-Komplexen experi- mentell sehr schwierig, sodass unsere Kenntnisse über diese entscheidenden Wechselwirkungen häufig limitiert sind. Oft ist noch nicht einmal bekannt, ob und an welcher Stelle ein Ligand im Enzym-gebundenen Zustand protoniert vorliegt. [2] Dieser Mangel an Kenntnissen resultiert zu einem großen Teil daraus, dass H-Atome normalerweise kaum über Rçntgen- strukturanalyse in Proteinkristallen zu lokalisieren sind, da sie nur ein einziges Elektron aufweisen. [3] Während die Beugung von Rçntgenstrahlung an Elektronen erfolgt, werden Neutronen an Atomkernen gestreut. Aus diesem Grund ermçglicht die Neutronenkristallographie die gesi- cherte Detektion von, und sogar die Unterscheidung zwi- schen, Wasserstoff- und Deuteriumatomen, da diese entwe- der als negative oder als positive Streulängendichtemaxima in den so genannten Neutronstreulängen-Dichtekarten (in der Folge vereinfacht als „Neutronen-Dichtekarten“ bezeichnet) schon bei moderater Auflçsung detektierbar sind. [4] Dennoch ist mit ca. 100 Einträgen in der Protein Data Bank (PDB) die Anzahl an Neutronenstrukturen immer noch sehr gering. Bei den Trypsin-ähnlichen Serinproteasen handelt es sich um Enzyme, die in vielen biologischen Prozessen involviert sind, wie der Blutgerinnung, Krebs-Metastase, Verdauung oder Immunantwort. [5] Für unsere Arbeit haben wir aus dieser Familie das Trypsin gewählt, um an dieser archetypi- schen Protease Prinzipien der Protein-Ligand-Wechselwir- kung mittels Rçntgen- und Neutronenkristallographie zu untersuchen. Trypsin erkennt und spaltet bevorzugt peptidi- sche Substrate, die eine basische Aminosäure wie Arginin oder Lysin auf der N-terminalen Seite vor der zu spaltenden Peptidbindung aufweisen. [5] Asp189, das tief vergraben am Ende der S1-Tasche vorliegt, ist für die hohe Substratspezi- fität der basischen Aminosäuren verantwortlich, wird aber auch häufig zur Verankerung von Inhibitoren an der Protease verwendet. [6] Während Substrat-ähnliche Inhibitoren mit stark basischen Kopfgruppen, wie Benzamidin, von einer io- nischen Wechselwirkung unter Bildung von Wasserstoffbrü- cken („Salzbrücke“) mit Asp189 profitieren, ist offen, ob Kopfgruppen geringerer Basizität in dieser Erkennungstasche auch protoniert vorliegen. Wir untersuchten daher in Trypsin zwei solche Verbindungen mit schwach basischen Gruppie- rungen, nämlich Anilin und 2-Aminopyridin, zwei Substan- zen, deren Eigenschaften chemisch sehr gut charakterisiert sind. [6, 7] Wir stellten uns die Frage, ob Anilin trotz seines niedrigen pK a -Werts von 4.6 (Tabelle 1) [8] im physiologischen pH-Bereich als Kation oder als neutrale Verbindung an Rindertrypsin bindet. Damit Anilin im Proteinkomplex beim experimentellen pH-Wert von 7.5 protoniert vorliegt, wäre somit eine Verschiebung des K a -Werts um vier Grçßenord- nungen nçtig. Im Unterschied dazu sollte 2-Aminopyridin, dessen pK a -Wert bei 6.9 liegt, leichter protonierbar sein. Prinzipiell kçnnen sich für dieses Molekül sogar zwei Tauto- mere bilden. Solche Tautomerien kçnnen bei vielen Wirk- stoff-ähnlichen Verbindungen auftreten, und wenn sie in Screening-Bibliotheken als Testsubstanzen verwendet werden, ist es somit entscheidend, welches Tautomer der potenziell ionisierbaren Gruppierungen bei der Komplexbil- dung im protonierten Zustand vorliegt. [9] [*] Dr. J. Schiebel, A. Sandner, K. Ngo, H.-D. Gerber, Prof.Dr. A. Heine, Prof. Dr. G. Klebe Institut für Pharmazeutische Chemie Philipps-Universität Marburg Marbacher Weg 6, 35032 Marburg (Deutschland) E-Mail: klebe@mailer.uni-marburg.de Dr. J. Schiebel, Dr. R. Gaspari, Prof.Dr. A. Cavalli CompuNet, Istituto Italiano di Tecnologia Via Morego 30, 16163 Genua (Italien) Dr. A. Ostermann Heinz Maier-Leibnitz Zentrum, Technische Universität München Lichtenbergstraße 1, 85748 Garching (Deutschland) Hintergrundinformationen und die Identifikationsnummer (ORCID) eines Autors sind unter: http://dx.doi.org/10.1002/ange.201701038 zu finden. Angewandte Chemie Zuschriften 4965 Angew. Chem. 2017, 129, 4965 –4969 # 2017 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim