— 687 — AIDA (2009), XIII Jornadas sobre Producción Animal, Tomo II, 687-689 DETECCIÓN DEL RECEPTOR DE LEPTINA EN EL OVARIO DE CONEJA E INFLUENCIA DE LA LEPTINA SOBRE LA MADURACIÓN DE LOS OOCITOS IN VITRO Arias-Álvarez M. 1 , García-García R.M. 1 , Rebollar P.G. 2 , Revuelta L. 1 , Lorenzo P.L. 1 1 Dpto. Fisiología (Fisiología Animal). Facultad de Veterinaria. UCM. 2 Dpto. Producción animal. E.T.S.I. Agrónomos. UPM. INTRODUCCIÓN La leptina es una hormona de 16 KDal producida por el gen de la obesidad (ob gen) que se sintetiza principalmente en los adipocitos (Zhang et al., 1994); refleja la cantidad de grasa de un animal y la condición corporal (Fortun-Lamothe, 2006), estando implicada en la regulación del peso corporal (Coleman et al., 1978) y en el éxito reproductivo (Chehab et al., 1996). En este sentido, se ha sugerido que la influencia de la leptina sobre la reproducción se ejercería sobre el eje hipotálamo- hipófisis (Brechia et al. 2006) y sobre algunos aspectos de la función ovárica, como el desarrollo folicular (Brannian et al., 2002) y la maduración de los oocitos (Ryan et al., 2002) a través de su unión con receptores específicos de membrana (Ob-R) (Tartaglia et al., 1995). El Ob-R es miembro de la clase I de la superfamilia de los receptores de citoquinas, y tiene 6 isoformas (Tartaglia et al., 1995). Tanto la forma larga como las cortas poseen el mismo dominio extracelular, por lo que se diferencian entre sí por el dominio intracitoplasmático (Fruhbeck, 2006). La detección del Ob-R en las células de la granulosa del ovario y en el oocito de diferentes especies sugiere que el oocito puede responder a la leptina a través de su receptor (Matsuoka et al., 1999; Craig et al., 2004) en particular, durante la maduración del mismo. Este proceso, a su vez, representa dos sucesos biológicos diferenciados: a) maduración nuclear (de vesícula germinal a metafase II); b) maduración citoplásmica (migración de los gránulos corticales (GC)). Este estudio, pretende, por un lado, determinar la inmunolocalización del Ob-R en el ovario de la coneja y por otro dilucidar el efecto de la leptina sobre la maduración de los oocitos de coneja in vitro tanto nuclear como citoplasmática. MATERIAL Y MÉTODOS Los ovarios proceden de conejas adultas sacrificadas en el matadero (Jumogar S.L.). Inmunodetección del receptor de la leptina. Los ovarios fueron fijados en paraformaldehido 4%, y se prepararon para histología según protocolos estándar. Tras el desparafinado y rehidratación, se realizó un tratamiento de calor con olla en buffer citrato 10mM (pH 6). Posteriormente, se suprimió la actividad de la peróxidasa con 0,3% de peróxido de hidrógeno, las secciones se incubaron con suero de bloqueo durante 30 min (1:10, Vector lab.) y a continuación con el anticuerpo primario (1:50, Vector lab.) durante toda la noche a temperatura ambiente. Después, se añadió el anticuerpo secundario (1:200, Vector), el conjugado ABC (Avidin biotin complex, ABC Vector Elite kit, Vector lab.) y, por último, el cromógeno (Vector Nova RED substrate Kit for Peroxidase, Vector lab.). Finalmente, se realizó una tinción de contraste con hematoxilina y se examinó al microscopio óptico. Maduración in vitro. Se aspiró el contenido de los folículos antrales visibles en la superficie del ovario, superiores a 1mm de diámetro (Jelinkova et al., 1994). Los complejos cúmulo oocito (COC) fueron seleccionados para cultivo en base a criterios morfológicos de homogeneidad en el cúmulo y en el citoplasma descritos por Lorenzo et al., (1994). El medio de maduración (MIV) estaba compuesto por TCM-199, piruvato sódico (0,1mg/ml), glutamina (2mM), antibiótico (100UI/ml penicilina-estreptomicina) y factor de crecimiento epidérmico (EGF) (10ng/ml) suplementado con: 0, 1, 10, 100 ng/ml de leptina o 10% de suero fetal bovino (FCS) (Sigma). El cultivo se realizó 500 μl de medio MIV, a 38º C, 5% de CO 2 y 100% de humedad relativa, durante 16h.