________________ 1. Departamento de Botânica, Centro de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Pernambuco. Av. Moraes Rego s/n Cidade Universitária Recife, PE, Brazil. 50670-901. E-mail: nestorpowell@yahoo.com.br 2. Departamento de Biologia, Universidade Federal Rural de Pernambuco. Av. Dom Manoel de Medeiros, s/n, Recife, PE, CEP 52171- 900. 3. Department of Zoology, University of Oxford, South Parks Road, OX1 3PS, Oxford, United Kingdom. NESTED PCR NA DETECÇÃO DE MIXOMICETOS EM CEREUS SQUAMOSUS Nestor Valente Powell 1 , David Barreiro Nunes Lemos 1 , Leandro de Almeida Neves Nepomuceno Agra 1 , Andrea Carla Caldas Bezerra 1 , Iêda Ferreira de Oliveira 2 , Maria Isabel Gomes Martins 2 , Kaliny Veiga Pessoa da Silva 2 , Reginaldo Carvalho 2 José Barbosa Cabral e Anna Maria Fiore-Donno 3 Introdução Mixomicetos são um grupo de microrganismos eucariotos que se alimentam de bactérias, fungos filamentosos, leveduras e outros microrganismos. Seu ciclo de vida é caracterizado por três fases distintas, duas fases tróficas (células amoeboflageladas e plasmódios) e uma fase reprodutiva (corpos de frutificação) onde se baseia a taxonomia do grupo [1]. Estudos sobre a ecologia de Myxomycetes realizados em diversas partes do mundo, inclusive no Brasil [2, 3, 4, 5, 6, 7, 8], baseiam-se apenas na fase reprodutiva do grupo podendo não demonstrar a real diversidade do ambiente, principalmente nas Regiões dos Trópicos, dita como a de maior diversidade mundial [9]. Dessa forma se faz necessário desenvolver outros métodos de identificação de espécies, como, por exemplo, o uso de técnicas da biologia molecular para as outras fases do ciclo de vida dos mixomicetos [10]. Uma variação da PCR (Polymerase Chain Reaction), conhecida como nested PCR (nPCR), é um procedimento que envolve duas etapas, no qual um par de iniciadores é usado para amplificar um fragmento e, em seguida, um segundo par de iniciadores é usado para amplificar um fragmento menor, a partir de uma alíquota da primeira PCR. Por ser uma técnica muito sensível e específica, tem sido descrita em estudos de diversos organismos, dentre eles, os mixomicetos [10, 11, 12]. A proposta do presente estudo foi testar o desempenho da nPCR na detecção de espécies destes organismos em amostras do facheiro. Material e métodos A. Coleta das amostras As amostras de facheiro vivo e morto foram coletadas em três pontos distintos, num fragmento de Caatinga localizado na Estação Experimental da Empresa Pernambucana de Pesquisa Agropecuária – IPA (8º14’18”S, 35º55º20”W, 530m de altitude), localizada no município de Caruaru, situado no agreste pernambucano (Fig. 1). B. Extração do DNA O DNA foi isolado de duas amostras de cladódios vivo e morto de Cereus squamosus Guerck. (Facheiro) (Fig. 1), no Laboratório de Genética, Bioquímica e Sequenciamento de DNA Prof. Tânia Falcão (LGBS). Em cada ensaio foram utilizados 100 µg por amostra. A extração e purificação foram realizadas com o DNeasy Plant Mini (QIAGEN), segundo as recomendações do fabricante. No final do procedimento, o material foi ressuspendido em um volume total de 450 l de buffer. C. Nested PCR As amplificações foram conduzidas com iniciadores desenhados para a pequena subunidade do gene RNA ribossomal (SSU DNAr). Para o primeiro e segundo grupo de reações, foram utilizados os seguintes pares de iniciadores: SSUam; SR1Dark/SR4Dark (poços B-E e F-I), específicos para espécies com esporos escuros e SSUam; SF1Tri /SR4Bright (poços J-M e N-Q), específicos para espécies com esporos claros (Fig. 2). Cada tubo de reação consistiu em um volume final de 15 l, utilizando-se a seguinte mistura: 1,5 l de tampão 10x de Taq DNA polimerase; 1,5 mM de MgCl 2 ; 0,2 mM de cada dNTP; 200 pmol de cada iniciador e DNA molde de cada indivíduo. A amplificação foi realizada em um termociclador PTC 100 (MJ Research, Waltham, Mass.). O programa consistiu de um passo inicial de desnaturação a 92ºC por 5 minutos e 40 ciclos a 92ºC por 15 segundos, 55ºC por 1 minuto e 72ºC por 1 minuto, seguido por um passo final de extensão a 72ºC por 10 minutos. Os produtos de PCR foram analisados por eletroforese em tampão TAE 1x, usando 1,2% de gel de agarose conduzida a uma voltagem constante de 120 V, por 100 minutos. O DNA Ladder 1 kb (Fermentas) foi usado como padrão de peso molecular. As amostras coradas com SYBR Gold 1x (Invitrogen) foram visualizadas sob luz ultravioleta (UV) e fotografadas com câmara digital (Figura 2). Resultados e Discussão A técnica nPCR foi capaz de gerar produtos de diferentes tamanhos nas amostras testadas, variando de 750 a 1000 pb. No entanto, não foi amplificado DNA específico para espécies de esporos claros. Isto pode ser devido à ausência de organismos deste grupo nas amostras analisadas ou, alternativamente, às condições de PCR adotadas no experimento, por exemplo, a seqüência dos iniciadores e a temperatura de anelamento adotada. A nPCR demonstrou ser uma técnica rápida e específica para diagnose de espécies de mixomicetos em diversos substratos. Contudo, outros estudos devem ser realizados com o método de diluições seriais para determinar o desempenho e reprodutibilidade deste ensaio de nPCR. Estudos futuros poderão elucidar a possível baixa