30 algas 43 GENERADOR DE NÚMEROS ALEATORIOS PARA RECUENTOS EN MICROSCOPÍA ÓPTICA Saúl Blanco Departamento de Biodiversidad y Gestión Ambiental, Universidad de León, E-24071 León, España E-mail: sblal@unileon.es Prácticamente todos los métodos de recuento de organismos en microscopía óptica presuponen un reparto uniforme y homogéneo de los elementos a enumerar en las preparaciones, pero esta condición rara vez se cumple, lo cual puede introducir sesgos importantes en los sub- siguientes análisis estadísticos (Kelly 1999). Por ejemplo, las preparaciones microscópicas permanentes de diatomeas suelen montarse dejando evaporar un cierto volumen de una suspensión de frústulos sobre cubreobje- tos circulares (Blanco et al. 2008). Eaton y Moss (1966) y Battarbee (1973) demostraron que las diatomeas en estas preparaciones no se distribuyen aleatoriamente debido a los efectos de la tensión superficial del agua. Acelerar el proceso con calor normalmente empeora esta uniformi- dad, ya que las corrientes de convección que se forman aumentan la cohesividad de las partículas y la formación de agregados, obteniéndose muestras con repartos he- terogéneos de las distintas clases de tamaño presentes (Schrader 1974; McBride 1988). Alverson et al. (2003) mostraron además que la densidad celular suele ser mayor en la zona central de los cubreobjetos. Los microscopistas normalmente elaboran recuentos realizando transectos sistemáticos en dirección horizon- tal, comenzando por uno de los bordes de la preparación, hasta haber contabilizado un número determinado de ele- mentos y/o campos visuales. En muestras especialmente densas, se corre el riesgo de completar la enumeración habiendo barrido una fracción no representativa de toda la preparación, con lo cual no se obtiene una imagen realista de las verdaderas proporciones numéricas existentes entre los diferentes taxones. Una forma de compensar la falta de uniformidad en el reparto de los elementos a contabi- lizar consiste en realizar un muestreo aleatorio por toda la preparación, y de hecho los protocolos normalizados de análisis diatomológicos recomiendan el uso de gener- adores de números aleatorios para realizar recuentos (European Committee for Standarization, 2004). La mayoría de los microscopios ópticos modernos están provistos de unos ejes coordenados graduados (escala de Vernier) que dan cuenta de la posición de la pletina donde se coloca la muestra en sentido vertical y horizontal. Aprovechando esto, he diseñado una sencilla hoja de cálculo en Excel para generar aleatoriamente coordenadas de campos visuales, aplicable para prepara- ciones con cubreobjetos o cubetas de decantación circu- lares (Tabla 1). Introduciendo las coordenadas del borde superior ("Initial position") (Fig. 1) y el diámetro de la preparación ("Coverslip diameter"), la hoja calcula suce- sivamente diferentes campos visuales ("FOVs") distribui- dos al azar por toda la muestra, haciendo uso de la función de generación de números pseudoaleatorios de este pro- grama (Fig. 2). El algoritmo consiste simplemente en cal- cular el centro de la preparación y generar a partir de esa posición diferentes coordenadas polares aleatorias que posteriormente se transforman en coordenadas rectangu- lares (Tabla 1). No se tiene en cuenta la posible repetición en el tiempo de pares de coordenadas, pero esto es en cualquier caso altamente improbable en muestras sufi- cientemente densas. La hoja también contabiliza el número de campos visuales acumulados (Fig. 3), lo cual es de utilidad en análisis cuantitativos. Ya que esta carac- terística emplea celdas autorreferenciadas, para que fun- cione correctamente es necesario tener habilitado el cál- culo iterativo en Excel, con los parámetros propuestos por defecto (100 iteraciones máximas y 0,001 unidades de cambio máximo). Esta opción se encuentra disponible en Menu Herramientas / Opciones ' Cálculo ' Iteración (Excel 2003), o bien Archivo ' Opciones ' Fórmulas (Excel 2007 y 2010). Para conservar esta funcionalidad, es necesario no guardar los cambios al cerrar la hoja. Los interesados pueden solicitar al autor una copia del correspondiente archivo. Figura 1. . Posición iniciall. Métodos