permettent de prédire/garantir l’efficacité sur le champignon in vivo. Différents paramètres peuvent diminuer l’action des antifon- giques in vivo : interactions médicamenteuses, liaison aux protéines plasmatiques, diffusion tissulaire, insuffisances rénale ou hépatique, etc. Un outil permettant d’évaluer l’activité antifongique plasma- tique, tenant compte des facteurs intrinsèques, semble nécessaire. Nous avons mis au point une technique simple et rapide permettant d’évaluer l’activité inhibitrice du plasma des patients sous antifon- giques. Mate´rieletme´thodes.— La détermination de l’activité inhibitrice du plasma a été réalisée à partir de plasma de patients traités par voriconazole. La diffusion en disque (adaptée du CLSI) a été privilé- giée pour sa simplicité. Les souches de références ATCC de C. albicans et C. parapsilosis ont été testées. Une gamme étalon a été réalisée avec des dilutions (eau-DMSO10 %) sérielles de voriconazole : l’adjonction de plasma témoin a été testée dans un second temps. Trente plasmas de patients traités par voriconazole et pour lesquels un dosage plasmatique était disponible dans le cadre du suivi thérapeutique pharmacologique de routine ont été analysés. Les diamètres inhibiteurs des disques imprégnés du plasma de ces patients ont été confrontés à la gamme d’étalonnage. Re´sultats et conclusion.— Pour des concentrations égales : — l’inhibition obtenue avec le plasma des patients est strictement comparable, voire supérieure, à celle obtenue avec la gamme étalon ; — les plasmas de concentrations identiques, mais de patients différ- ents, ont le même pouvoir inhibiteur. En conclusion, nous avons obtenu une excellente corrélation entre la concentration plasmatique du voriconazole et l’activité inhibitrice du plasma et cette corrélation ne semble pas patient-dépendante. Les perspectives de cette étude sont triples : — pour les antifongiques dont les dosages plasmatiques sont encore peu développés : possibilité d’évaluer rapidement le pouvoir inhi- biteur du plasma. Des cinétiques seront nécessaires afin d’établir le moment optimum du prélèvement ; — lorsque les dosages plasmatiques sont disponibles : mise en évidence de facteurs interférents ; — cette technique peut être adaptée à tout liquide biologique qui pourra être testé vis-à-vis de la souche infectante du patient. Une évaluation prospective est nécessaire afin de confirmer l’intérêt de cette technique sur la prise en charge globale des patients sous antifongiques. http://dx.doi.org/10.1016/j.mycmed.2012.12.016 Clonage et expression de la protéine 14-alpha- déméthylase de Candida albicans chez Pichia pastoris E. Robert, N. Alvarez Rueda * , P. Le pape De ´ partement de parasitologie et de mycologie me ´ dicale, universite ´ de Nantes, Nantes Atlantique universite ´ s, EA1155—IICiMed, faculte ´ de pharmacie de Nantes, Nantes, France *Auteur correspondant. Adresse e-mail : nidia.alvarez-rueda@univ-nantes.fr. L’enzyme 14-alpha-déméthylase (CaErg11p, CaCYP51) codée par le gène CaERG11 chez Candida albicans est impliquée dans la bio- synthèse de l’ergostérol, principal stérol de la membrane plasmique des micromycètes. Cette enzyme est nécessaire à l’élimination d’un groupement méthyle sur le carbone 14 du squelette stéroïde du lanostérol. Son inhibition par les antifongiques azolés aboutit à l’accumulation de stérols 14-méthyl 3, 6 diol toxiques pour la levure. L’utilisation de certains azolés en prophylaxie ou en curatif a for- tement contribué à l’apparition de phénomènes de résistance ayant pour origines, la surexpression et/ou les mutations des gènes codant pour les pompes à efflux (CDR1, CDR2, MDR1) et la surexpression et/ ou les mutations du gène CaERG11. Concernant ce dernier gène, nombreuses sont les mutations décrites dans la littérature et l’impact des substitutions d’acides aminés correspondantes sur l’interaction avec les azolés est encore aujourd’hui estimé par un modèle 3D d’homologie entre la séquence protéique et la structure cristallisée du CYP51 de Mycobacterium tuberculosis. Or, les différences de séquences sont telles que l’expli- cation de l’impact n’est pas toujours possible. L’expression hétéro- logue et la purification de la protéine CaErg11p deviennent alors indispensables pour les études de cristallisation et de modélisation. Par ailleurs, un modèle plus pertinent permettrait le docking ration- nel de nouvelles molécules antifongiques. D’autre part, l’obtention de la protéine recombinante permettrait le criblage de molécules par inhibition de son activité enzymatique. L’implication des mutations K143R et S405F dans la résistance aux azolés a été récemment confirmée par des études d’expression hétérologue chez la levure S. cerevisiae ; ces substitutions inter- venant probablement dans une diminution de l’affinité cible-médi- cament. Nous avons introduit ces deux mutations dans le gène CaERG11 par mutagenèse dirigée et ajouté un tag histidine pour sa purification. Le clonage du gène a été effectué dans un plasmide d’expression chez la levure Pichia pastoris. L’expression de la protéine recombinante ERG11p (CYP51) dans le surnageant de cul- ture de P. pastoris a été suivie après induction dans le milieu méthanol (BMMY) pendant sept jours. Après concentration et migra- tion sur gel de polyacrylamide 10 %, puis transfert sur membrane de nitrocellulose, la protéine a été révélée à l’aide d’un anticorps anti- histidine et d’un sé rum polyclonal anti-CYP51 de levure. Parallèle- ment, les protéines ont été purifiées par chromatographie d’affinité sur colonne de Nickel Hi-Trap. Les rendements de purification ainsi que les difficultés liées à la dégradation protéique sont discutés. Au final, la purification des enzymes poly-mutée et sauvage vise à réaliser des études de modélisation moléculaire et de criblage de nouvelles molécules antifongiques capables de contourner certains mécanismes de résistance. http://dx.doi.org/10.1016/j.mycmed.2012.12.017 Activité antifongique de nouvelles nanoparticules PLA-PEG d’amphothéricine B et de voriconazole vis-à-vis de candida et aspergillus V. Aoun a , F. Pagniez b , P. Hildgen a , G. Leclair a , P. Le Pape b, * a Faculte ´ de pharmacie, universite ´ de Montre ´al, CP 6128, Succursale Centre-ville, Montre ´al, QC, H3C 3J7, Canada b De ´ partement de parasitologie et mycologie me ´ dicale, EA 1155 IICiMed, UFR des sciences pharmaceutiques et biologiques, Nantes Atlantique universite ´ s, Nantes, France *Auteur correspondant. Adresse e-mail : patrice.le-pape@univ-nantes.fr. Le spectre large d’activité antifongique du voriconazole (VRZ) et de l’amphothéricine B (AMB) constitue un élément majeur dans la prise en charge des mycoses invasives en particulier celle des candidoses profondes ou des aspergilloses invasives. La faible tolérance rénale de l’AMB a été par la suite améliorée par les formes galéniques lipidiques ou liposomales et l’hydrophobicité du VRZ a imposé une complexation avec des b-cyclodextrines pour l’administration par voie parentérale. Ces différentes formulations sont par contre coûteuses, peu stables ou peuvent limiter le relargage du principe actif. Afin d’améliorer l’efficacité et la biodisponibilité de ces deux molé- cules, une nouvelle formulation galénique a été développée par inclusion de l’antifongique dans des nanoparticules polymériques biodégradables composées d’acide polylactique (PLA) sur lequel est greffé du polyéthylène glycol (PEG). La modification à façon des pourcentages respectifs de ces composants permet de contrôler le relargage du principe actif et de modifier les caractéristiques de surface des particules afin d’améliorer l’interaction avec l’agent 74 Compte rendu de congrès/Proceeding of congress