A PCR-based method to detect species of Gondwanamyces and Ophiostoma on surfaces of insects colonizing Protea flowers Francois Roets, Michael J. Wingfield, Le ´ anne L. Dreyer, Pedro W. Crous, and Dirk U. Bellstedt Abstract: Flower heads of economically important members of the genus Protea L. mature into conspicuous, often long- lived infructescences, which in South Africa are commonly colonized by species of the ophiostomatoid fungi Gondwana- myces G.J. Marais & M.J. Wingfield and Ophiostoma Syd. & P. Syd. It is suspected that these fungi are transported be- tween infructescences by insects. To develop techniques that would enable detection of ophiostomatoid fungi on insects, primers GPR1 and OSP1 were designed based on unique 28S ribosomal DNA sequences of Gondwanamyces and Ophios- toma from Protea. Multiplex polymerase chain reaction of these primers, combined with universal primer LR6, yielded fragment lengths of 885 and 637 bp. Positive amplification was achieved from as little as 30 and 45 pg of fungal genomic DNA for Gondwanamyces and Ophiostoma, respectively, and fragments of identical lengths were amplified from insects artificially inoculated with these fungi. No other tested fungal species showed amplification with GPR1 or OSP1 and LR6. Using these primers two insect species (Genuchus hottentottus Fabricius and Oxycarenus maculates Stal.) collected from Protea repens L. infructescences were confirmed as carriers of Gondwanamyces proteae (M.J. Wingfield et al.) G.J. Marais & M.J. Wingfield and Ophiostoma splendens G.J. Marais & M.J. Wingfield, respectively. The method devel- oped in this study represents a rapid detection system that can be used to understand the relationship between insects and ophiostomatoid fungi found associated with flowers of South African species of Protea. Key words: insect-vectored fungi, fynbos, infructescence, ophiostomatoid fungi, Proteaceae. Re ´sume ´: Les cimes florales de membres e ´conomiquement importants du genre Protea L. mu ˆrissent sous forme d’infruc- tescences voyantes et de longue dure ´e, lesquelles sont souvent colonise ´es, en Afrique du Sud, par des espe `ces fongiques ophiostomatoı ¨des de Gondwanamyces G.J. Marais & M.J. Wingf et d’Ophiostoma Syd. & P. Syd. On pense que ces cham- pignons sont transporte ´s d’une infructescence a ` l’autre par des insectes. Afin de de ´velopper des techniques qui pourraient permettre la de ´tection des champignons ophiostomatoı ¨des sur les insectes, les auteurs ont de ´veloppe ´ les amorces GPR1 et OSP1, base ´es sur des se ´quences singulie `res de l’ADN ribosomal 28S de Gondwanamyces et d’Ophiostoma, provenant de Protea. Une polyme ´risation en chaı ˆne multiplex de ces amorces, combine ´e avec l’amorce universelle LR6, produit des fragments longs de 885 et 637 pb. On a obtenu une amplification positive a ` partir d’aussi peu que 30 et 45 pg d’ADN ge ´- nomique, pour les Gondwanamyces et Ophiostoma, respectivement, et on a pu amplifier des fragments de longueurs identi- ques a ` partir d’insectes artificiellement inocule ´s avec ces champignons. Aucune autre espe `ce fongique teste ´e n’a montre ´ d’amplification avec le GPR1 ou les OSP1 et LR6. En utilisant ces amorces, on a pu confirmer que deux espe `ces d’in- sectes (Genuchus hottentottus Fabricius et Oxycarenus maculates Stal.), re ´colte ´es sur des infructescences de Protea repens L., constituent des vecteurs du Gondwanamyces proteae (M.J. Wingfield et al.) G.J. Marais & M.J. Wingfield et de l’Ophiostoma splendens G.J. Marais & Wingfield, respectivement. La me ´thode de ´veloppe ´e dans cette e ´tude constitue un syste `me rapide de de ´tection, qui peut e ˆtre utilise ´ pour comprendre la relation entre les insectes et les champignons ophios- tomatoı ¨des associe ´s aux fleurs des espe `ces sud-africaines de Protea. Mots cle ´s : insectes vecteurs de champignons, fynbos, infructescenses, champignons. [Traduit par la Re ´daction] Received 30 August 2005. Published on the NRC Research Press Web site at http://canjbot.nrc.ca on 1 August 2006. F. Roets and L.L. Dreyer. 1 Department of Botany and Zoology, and Department of Plant Pathology, University of Stellenbosch, Private Bag X1, Matieland, 7602, South Africa. M.J. Wingfield. Forestry and Agricultural Biotechnology Institute, University of Pretoria, Lynwood Road, Hillcrest, Pretoria, 0002, South Africa. P.W. Crous. Centraalbureau voor Schimmelcultures, Fungal Biodiversity Centre, P.O. Box 85167, 3508 AD, Utrecht, Netherlands. D.U. Bellstedt. Department of Biochemistry, University of Stellenbosch, Private Bag X1, Matieland, 7602, South Africa. 1 Corresponding author (e-mail: ld@sun.ac.za). 989 Can. J. Bot. 84: 989–994 (2006) doi:10.1139/B06-062 # 2006 NRC Canada