ANÁLISIS ÓPTICO DE MICRO-MATRICES DE FLUORESCENCIA SOBRE SOPORTES DE GRABACIÓN DIGITAL CONVENCIONALES David Mira Roberto Llorente Ángel Maquieira Javier Martí Centro de Tecnología Nanofotónica Centro de Tecnología Nanofotónica Departamento de Química Centro de Tecnología Nanofotónica Universidad Politécnica de Valencia Universidad Politécnica de Valencia Universidad Politécnica de Valencia Universidad Politécnica de Valencia damisal@ntc.upv.es rllorent@ntc.upv.es amaquieira@qim.upv.es jmarti@ntc.upv.es Abstract- In this paper is reported the optical parallel analysis of Cy5 fluorophore micro-arrays over polycarbonate and polyethylene metacrilate substrates as those found in standard digital recording media. The sequential printing of biochemical samples, CCD detection, enhanced analysis by signal processing and assay results recording as digital data on a consolidated substrate is implemented. The developed equipment finds its application in low-cost ultra high throughput screening of massive chemical, biochemical or cellular agents. I. INTRODUCCIÓN Las técnicas de análisis paralelo de alto rendimiento (HTS “High Throughput Screening”) aprovechan la miniaturización y el tratamiento en paralelo de los análisis. La deposición y el análisis de micro-matrices (diámetro de muestra entre 100 y 200 µm), integrado en un mismo equipo es la solución al volumen de análisis requerido en campos como la genómica y la proteómica. Estas micro-matrices son utilizadas principalmente en medicina y biología molecular, su aplicación abarca alimentación, medioambiente y aplicaciones de seguridad y defensa. Hasta la fecha principalmente se utilizan dos técnicas para el análisis paralelo de estas micro-matrices: (i) El barrido con láser y detección con tubo fotomultiplicador (PMT “Photo- Multiplier Tube”), y (ii) Excitación mediante una fuente de luz blanca y detección con un sistema CCD. El uso de CCDs de cámaras digitales comerciales en la detección directa de fluorescencia es una solución de bajo coste para aplicaciones con requerimientos de análisis medios [1], otra ventaja de los equipos basados en CCD es la posibilidad de detectar simultáneamente señales fluorescentes y bioluminiscentes [2]. Este esquema ha sido aplicado con éxito en inmunoensayos o métodos basados en hibridación de ácidos nucleicos [3][4] pero se requieren tiempos de integración largos. Los continuos avances en los marcadores fluorescentes y en la sensibilidad de los CCDs reducen este tiempo y permiten su uso en aplicaciones HTS. El nivel de reacción de cada elemento de la matriz se evalúa mediante la detección directa de la intensidad de fluorescencia. Hasta la fecha se han descrito otras técnicas de detección de fluorescencia tales como: (1) Espectroscopia de correlación de fluorescencia [5][6], (2) Microscopio confocal de fluorescencia, (3) Muestreo de fluorescencia basado en la duración de la emisión [7] y (4) Microscopio de reflexión total interna. Todas estas técnicas requieren de fuentes de luz monocromáticas de alta intensidad (comúnmente láseres de onda continua o pulsados) y detectores PMT los cuales son equipos costosos. Asimismo, los periodos de exposición largos a una intensa iluminación limitan su viabilidad en células y tejidos e introducen un fenómeno de fotodecaimiento (“photo-bleaching”). Las cámaras CCD de alta eficiencia cuántica son la solución para sustituir a los detectores PMT. En este trabajo de longitud de onda de excitación se consigue mediante un económico conjunto de matrices de LEDs (“Light Emitting Diodes”) y filtros si es necesario optimizar al máximo posible la respuesta del sistema, los cuales pueden configurarse de manera que permitan el análisis de diferentes fluoróforos de manera sencilla y económica. La excitación limitada en ancho de banda de los LEDs es más eficiente que la excitación de las fuentes de luz blanca. Además, los resultados demuestran un funcionamiento equivalente al de los microscopios basados en láser. Por otra parte, el esquema basado en LED/CCD que proponemos tiene las ventajas de permitir multidetección (ensayos en paralelo), portabilidad, rapidez y sencillo ajuste para diferentes fluoróforos. II. DEMOSTRADOR HTS En la Figura 1 se muestra un esquema del funcionamiento del demostrador HTS implementado. Como puede observarse, integra todos los pasos de un análisis: (a) deposición de las micro-matrices, (b) detección de la reacción de marcado, (c) software de análisis y (d) almacenamiento digital de los datos resultantes del análisis. Los objetivos del diseño son alcanzar un coste global de sistema reducido y mantener una arquitectura abierta para favorecer migraciones a nuevos escenarios de análisis (diferentes marcadores o sustratos). La estrategia del sistema se basa en usar como sustrato medios de grabación digitales