Maskierte Fluoreszenzfarbstoffe DOI: 10.1002/ange.201000150 Rhodamine NN: eine neue Klasse maskierter Fluoreszenzfarbstoffe** Vladimir N. Belov,* Christian A. Wurm,* Vadim P. Boyarskiy, Stefan Jakobs und Stefan W. Hell* Maskierte Fluoreszenzfarbstoffe werden durch Einführung einer photochemisch labilen Gruppe in einem nichtfluores- zierenden Zustand gehalten. Durch Bestrahlung mit UV- Licht kommt es zur Abspaltung der Maskierungsgruppe und somit zur Freisetzung des fluoreszierenden Farbstoffs. [1a–c] Der Bedarf an maskierten Fluoreszenzfarbstoffen für die Mikroskopie biologischer Proben ist sehr hoch, da diese unter anderem zur Analyse von Proteindynamiken, [1d,e] für die Mehrfarben-Fluoreszenzmikroskopie [1f] und für die optische Nanoskopie [1g] eingesetzt werden können. Als Maskierungs- gruppen werden oftmals o-Nitrobenzyl-Gruppen genutzt. Aufgrund ihrer schwierigen Synthese und der Freisetzung unerwünschter Nebenprodukte bei der Photolyse ist die Einsetzbarkeit dieser Farbstoffe jedoch begrenzt. Hier berichten wir über die Synthese und Charakterisie- rung einer neuen Klasse maskierter Fluoreszenzfarbstoffe: Die Rhodamin-NN-Farbstoffe zeichnen sich durch eine 2- Diazoketon-Gruppe (COCNN) aus, die in ein Spiro-9H- xanthen-Fragment eingebaut ist (Verbindungen 3 und 9-R in Schema 1 bzw. Schema 3). Die kleine 2-Diazoketon-Gruppe ist das Kernelement dieser neuen Klasse maskierter Rhod- amine mit außergewöhnlichen Eigenschaften : Rhodamin NN kann leicht hergestellt, an Biomoleküle konjugiert und mit Wellenlängen unterhalb von 420 nm schnell zu hell fluores- zierenden Derivaten demaskiert werden, ist in wässrigen Puffern sowie in verschiedenen Einbettungsmedien einsetz- bar und eignet sich gut für den Einsatz in der Lichtmikro- skopie. In der Lichtmikroskopie können die neuen maskierten Rhodamine einzeln oder in Kombination mit herkömmlichen Fluoreszenzfarbstoffen und schaltbaren Rhodamin-Spiro- amiden verwendet werden. [2] Somit ist es möglich, neue Bildgebungsverfahren zu nutzen, die auf der stufenweisen Aktivierung und Detektion verschiedener Fluorophore be- ruhen. Die Kombination der neuen Rhodamin-NN-Farbstoffe 9-R mit dem photochromen Spiroamid von Rhodamin S [2e] und einem nicht maskierten N,N,N’,N’-Tetramethylrhodamin ergibt ein monochromatisches Multimarker-Mikroskopie- schema, [3] das trotz Verwendung von Fluorophoren mit ähn- lichen Absorptions- und Emissionsspektren eine niedrige gegenseitige Beeinflussung („crosstalk“) zwischen den ein- zelnen Fluoreszenzkanälen aufweist. [2d, 4] Rhodamine sind sehr photostabile und helle Fluores- zenzfarbstoffe, die leicht chemisch modifiziert [5] und maskiert werden können. [6] Cumarine [7] und Fluorescein [8] können ebenfalls als maskierte Fluoreszenzfarbstoffe eingesetzt werden. [9] Als photolabile Einheiten enthalten die meisten maskierten Verbindungen eine 2-Nitrobenzyl-Gruppe oder Derivate mit einer Alkyl- oder Carboxygruppe in a-Stellung zum Phenylring (an der CH 2 -Gruppe) und/oder ein bis zwei Methoxygruppen am aromatischen Ring. [10] Für eine Bio- konjugation müssen diese Verbindungen zusätzlich über eine freie Carboxygruppe verfügen. Jedoch ist die Synthese von maskierten Rhodaminen mit einer freien („zweiten“) Carboxygruppe sehr schwierig und mit geringen Ausbeuten verbunden. [6a] Die 2-Nitrobenzyl-Gruppe und ihre Derivate sind sperrig, außerdem kommt es bei ihrer Photolyse zur Freisetzung hoch reaktiver 2-Nitrosobenzaldehyde oder 2-Nitrosobenzophe- none. Es wird vermutet, dass diese Verbindungen oder deren Oligomere für lebende Zellen toxisch sind. Da sie außerdem farbig sind, besteht die Gefahr, dass sie optische Messungen stören. Weitere Maskierungsgruppen mit der benötigten Ab- sorption im UV-Bereich sind ebenso recht groß und lipophil, und ihre Synthese sowie das Einbringen in Zellen ist oftmals schwierig. Beispielsweise wurde beschrieben, dass 2-(N,N- Dimethylamino)-5-nitrophenol eine Reihe photolabiler Phe- nylester bildet. [11] 7-Diethylamino-4-(hydroxymethyl)-2H- chromen-2-on bildet Ester, die durch Bestrahlung bei 412 nm leicht gespalten werden können. [12] Auch Derivate von 8- Brom-7-hydroxychinolinen [13] und 6-Brom-7-hydroxycumari- nen [14] wurden als lichtempfindliche Schutzgruppen vorge- schlagen. Jedoch entstehen bei der Photolyse derart mas- kierter Verbindungen ebenfalls lichtabsorbierende Neben- produkte. Wir haben uns entschlossen, maskierte Fluoreszenzfarb- stoffe ohne große Markierungsgruppen zu erzeugen. Ein kleines 2-Diazoketon-Fragment wäre eine ideale Maskie- rungsgruppe, sofern es möglich wäre, es in die farblose Form eines Farbstoffs zu integrieren und diesen dann durch Pho- tolyse in seine fluoreszierende Form zu überführen. Rhod- amine eignen sich sehr gut für diesen Zweck, da sie eine Carboxygruppe enthalten, die mit einem Spiro-9H-xanthen- Rest ein farbloses, nichtfluoreszierendes Lacton oder Lactam [*] Dr. V.N. Belov, Dr. C. A. Wurm, Dr. V.P. Boyarskiy, Dr. S. Jakobs, Prof. Dr. S. W. Hell Abteilung NanoBiophotonik Max-Planck-Institut für biophysikalische Chemie Am Fassberg 11, 37077 Göttingen (Deutschland) Fax: (+ 49) 551-201-2506 E-Mail: vbelov@gwdg.de cwurm@gwdg.de shell@gwdg.de Homepage: http://www.mpibpc.gwdg.de/abteilungen/200/ [**] Diese Arbeit wurde durch den Gottfried-Wilhelm-Leibniz-Preis der DFG (an S.W.H.) und die Max-Planck-Gesellschaft unterstützt. Die Autoren danken Donald Ouw (MPI), Reinhard Machinek, Dr. Holm Frauendorf und ihren Mitarbeitern (Institut für Organische und Biomolekulare Chemie, Georg-August-Universität Göttingen) für die Aufnahme von Spektren. Hintergrundinformationen zu diesem Beitrag sind im WWW unter http://dx.doi.org/10.1002/ange.201000150 zu finden. Zuschriften 3598  2010 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim Angew. Chem. 2010, 122, 3598 –3602