Approche métabolomique de l’amélioration de la tolérance au stress hydrique induite par l’acide βamino butyrique (BABA) chez le lin (Linum usitatissimum) Anthony Quéro 1 , Ophélie Fliniaux 1 , Redouan Elboutachfaiti 1 , Xavier Guillot 2 , Corinne PauRoblot 1 , François Mesnard 1 et Josiane Courtois 1 1 Laboratoire de BIOlogie des Plantes & Innovations EA 3900, UPJV, IUT / GB, Avenue des Facultés, Le Bailly, 80025 Amiens Cedex, France. 2 Laboulet Semences , 1 rue Carnot, 80270 Airaines, France. Témoin BABA RWC (%) * Témoin BABA 6H 24 H 48 H 96 H Temps en heure potentiel osmotique témoin BABA 0,75 0,85 0,95 1,05 6H 24 H 48 H 72 H 96 H 0,12 MPa 0,84 0,52 0,56 0,80 0,80 0,59 0,73 0,50 0,88 0,65 0,65 0,67 0,91 0,62 0,61 0,68 1,06 0,67 0,69 0,88 0,96 0,83 0,72 0,85 0,90 0,62 0,82 1,01 0,89 0,76 0,87 0,88 0,86 0,44 0,83 1,42 0,80 0,66 1,01 0,99 0,98 0,61 0,88 1,23 1,17 0,89 0,81 0,95 0,78 0,62 0,89 0,98 0,68 0,90 0,83 0,73 0,89 0,88 0,90 1,17 1,09 0,93 0,85 0,89 0,99 0,71 0,93 1,01 1,08 1,04 1,20 0,88 1,05 0,85 0,96 1,21 0,98 1,00 0,82 0,92 1,30 1,92 0,99 1,03 0,78 0,94 0,92 0,83 1,65 0,97 0,99 1,40 0,93 0,76 0,82 1,29 1,12 1,03 1,01 1,38 1,01 1,22 1,16 1,20 1,13 0,80 1,09 1,33 1,14 0,98 1,05 1,02 1,78 1,83 1,13 0,72 1,47 2,17 2,28 1,35 1,04 1,04 1,14 1,51 1,04 1,11 1,37 1,27 1,57 1,62 1,18 1,26 1,02 1,25 1,40 1,05 1,02 0,85 1,19 1,65 0,91 1,15 1,37 1,34 1,06 1,13 1,23 0,95 1,00 1,02 0,95 1,02 1,14 0,94 1,24 1,55 1,06 1,14 1,49 1,50 1,13 1,01 1,24 1,45 0,98 1,10 1,06 1,10 0,94 1,08 1,25 1,23 0,89 1,30 1,38 1,28 0,95 1,18 1,30 1,30 0,99 1,12 1,61 1,47 1,09 1,19 1,30 1,33 0,75 1,11 1,66 1,33 1,23 0,89 1,33 1,37 1,11 0,88 1,11 1,09 1,99 1,48 1,38 1,40 1,17 1,34 1,24 1,30 1,18 0,91 1,39 1,44 1,07 0,94 1,20 1,18 1,10 0,93 1,39 1,12 0,92 1,13 1,38 1,00 1,58 1,03 1,47 1,70 1,10 1,09 1,37 1,46 1,45 1,54 1,51 1,63 1,06 1,39 1,26 1,36 1,91 1,06 1,55 1,42 1,03 0,86 1,23 1,21 0,87 1,53 1,57 1,77 0,89 1,03 2,00 1,67 1,93 1,24 1,63 1,72 1,02 0,88 1,58 1,43 1,90 1,86 1,69 1,96 1,04 0,91 1,28 1,23 2,44 1,12 1,76 1,60 1,02 0,91 1,26 1,25 1,68 0,70 1,78 2,17 1,09 2,09 2,55 1,78 1,79 1,52 1,87 1,29 0,76 0,67 3,14 2,64 0,92 1,92 2,33 2,09 1,09 1,56 1,99 1,94 1,19 1,63 2,45 2,85 1,08 1,57 2,07 2,01 1,18 2,49 3,38 3,42 1,04 2,55 3,48 3,88 1,56 8,44 13,75 12,01 1,02 4,32 10,13 9,58 1,74 7,06 15,47 17,66 1,34 4,38 10,91 13,43 1,20 9,20 15,49 11,12 0,82 4,24 11,39 10,50 Choc osmotique BABA 6H 24 H 48 H 72 H 6H 24 H 48 H 72 H méthionine glutamate fumarate aspartate glutamine succinate glucuronate F6P thréonate G6P phénylalanine lysine citrate [4transcafféoylquinate] βalanine αcéto glutarate tartarate quinate sérine malate sorbose glycérate [érythréonate] putrescine lotaustraline thréonine linamarine acide trans cafféique valine saccharose tyrosine arabinose glycine isoleucine leucine alanine glucose xylose myoinositol galactose GABA proline fructose 18,00 10,00 5,00 3,00 1,00 0,80 0,40 Intensité du ratio Résultats Introduction Discussion Mise en évidence de la tolérance induite par le BABA Des plantes de lin ont été cultivées en terre pendant 15 jours avant d’être arrosées par une solution de BABA à 30 mg / L dans de l’eau, ou par de l’eau. Les plantes dont le dernier arrosage était uniquement constitué d’eau présentaient un flétrissement plus important que les plantestraitées avec du BABA. Ceci se traduisait par une teneur en eau plus importante dans les feuilles traitées par le BABA que dans les feuilles témoin, avec un contenu relatif en eau (RWC) respectif de 73 % et 39 % (figure 1). Matériels et méthodes Figure 1 : Contenu relatif en eau (RWC) dans les feuilles de lin après 10 jours d’un dernier arrosage en eau (témoin) ou en eau + BABA (30 mg / L) (BABA). Les astérisques indiquent que la différence est significative après un test de MannWhitney (P < 0,05) avec n = 5. Figure 2 : Empreinte métabolomique par spectre 1HRMN du métabolome des feuilles de lin cultivé en conditions favorables ou après application de BABA (10 mg / L). Les signaux de chaque spectre ont été normalisés pour permettre la comparaison des différentes conditions. Pour chaque condition, 6 spectres RMN 600 Mhz (n = 6) ont été réalisés et le spectre le plus représentatif a été représenté sur cette figure. Approche par empreinte métabolique de la réorganisation du métabolome induite par le BABA Pour savoir quels mécanismes sousjacents étaient impliqués dans l’amélioration de la tolérance induite par le BABA, le métabolome a été analysé. Dans un premier temps, la comparaison du Tableau 1 : Comparaison de la réorganisation du métabolome et du contenu en solutés minéraux suite à l’application de BABA (10 mg / L) ou après un choc osmotique (0,30 MPa). Les valeurs indiquées dans le tableau représentent le ratio (plantes traitées / plantes témoin). Lorsque le test statistique réalisé au sein de chacune des deux expérimentations est significatif (P < 0,05) le fond de la case est coloré et la légende de l’intensité de ratio est indiquée en bas à droite du tableau. Lorsque le test est nonsignificatif (P < 0,05), le fond de la case est blanc. Les noms des composés indiqués entrecrochets ont été identifiés à partir de la Golm Metabolome Database et de la correspondance de leur spectre de masse ainsi que de leur Retention Index (RI). Tous les autres composés ont été identifiés à partir d’un passage de standards purs. Des analyses par GCMS ont permis de déterminer la nature des composés impliqués dans la réorganisation du métabolome induite par le BABA (tableau 1) et ont confirmé les résultats obtenus par RMN. Ainsi, après 48 H de traitement, la réorganisation du métabolome se traduit essentiellement par une accumulation de solutés organiques. Le suivi de la teneur de 43 métabolites a mis en évidence que 23 d’entre eux s’accumulaient suite au traitement BABA. Cette accumulation est particulièrement spectaculaire pour le fructose, le glucose et la proline dont la teneur est multipliée par plus de 10 suite au traitement. Ces analyses montrent également que la réorganisation du métabolome induite par le BABA présentent de fortes similitudes avec celle obtenue lors d’un choc osmotique léger. Ces similitudes se retrouvent à la fois dans la nature des métabolites impliqués, mais aussi dans l’amplitude des variations obtenues et dans la cinétique de réponse de ces deux traitements. Installation de déviations osmotiques induites par le BABA En effectuant, le suivi du potentiel osmotique dans les feuilles du lin, il est apparu que le BABA induisait une diminution du potentiel osmotique (PO) qui s’opérait après 72 H de traitement. Après 96 H de traitement la diminution du PO s’accentuait (figure 3). Figure 3 : Suivi de l’installation de déviations osmotiques dans les feuilles de lin suite à l’applicationde BABA (10 mg / L) (n = 6). 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 20 40 60 80 100 Contenu en eau g.g 1 MS Temps en heures témoin BABA Figure 4 : Suivi du contenu en eau dans les feuilles de lin suite à l’applicationde BABA (10 mg / L) (n = 6). Rupture de l’homéostasie du statut hydrique induite par le BABA Le suivi du statut hydrique dans les feuilles de lin a mis en évidence que le BABA induit une diminution de la teneur en eau après 48 H de traitement. Cette diminution se prolonge jusqu’à 96 H (figure 4). Le lin oléagineux (Linum usitatissumum) est vulnérable aux conditions climatiques dans les régions tempérées dans lesquelles il est cultivé. Le manque d’eau est particulièrement délicat à gérer et entraîne des pertes de rendements sur la production de graines [1]. Pour pallier à ce problème, et pour revaloriser cette espèce végétale riche en composés d’intérêts (acide α linolénique, lignanes), des solutions doivent être apportées [2]. L’application de l’acide βamino butyrique (BABA) semble être une solution intéressante pour y parvenir. Historiquement, les travaux faisant intervenir le BABA en tant que potentialisateur des réactions de défense chez les végétaux se sont concentrés sur l’amélioration de la tolérance aux stress biotiques [3]. Récemment, l’intérêt porté à cet acide aminé nonprotéinogène a augmenté avec la découverte de son implication dans la tolérance aux stress abiotiques et notamment le stress hydrique [45]. Alors que beaucoup d’informations sont disponibles pour expliquer la résistance induite par le BABA lors des stress biotiques, très peu d’informations sont disponibles pour expliquer les mécanismes impliqués dans la tolérance au stress hydrique. Hormis la forte implication de l’ABA dans la tolérance au stress hydrique induite par le BABA, aucun autre mécanisme adaptatif relié à ce type de tolérance n’a été décrit jusqu’à présent. métabolome entre les plantes témoin et les plantes traitées s’est effectuée par empreinte métabolique. Les extraits bruts des feuilles prélevées 6, 24, 48 et 96 H après le début du traitement ont été analysés par RMN du proton (figure 2). Des différences majeures dans la composition du métabolome dans les deux conditions ont été révélées. Cette réorganisation du métabolome s’opère après 24 H de traitement et s’accentue après 48 H et 96 H. Elle est principalement retrouvée entre 3 et 4,5 ppm et elle est corrélée avec l’accumulation du BABA (1,3 ppm) dans les feuilles. Chevauchements importants dans la réorganisation du métabolome induite par un traitement BABA ou par un choc osmotique stress hydrique léger accumulation de solutés organiques diminution du potentiel osmotique acclimatation au stress hydrique Mécanismes sousjacents impliqués dans l’amélioration de la tolérance au stress hydrique induite par le BABA Stress hydrique léger induit par le BABA responsable de l’acclimatation de la plante La conduite des différents travaux a permis d’établir que le BABA induit une amélioration de la tolérance au stress hydrique chez le lin. Cette amélioration a déjà été décrite dans la littérature chez deux autres espèces végétales : Arabidopsis thaliana [4] et le pommetier [5]. Cette induction de la tolérance est associée à une réorganisation majeure du métabolome qui se traduit essentiellement par une accumulation de solutés organiques. Cette accumulation de solutés peut être considérée comme une réponse positive de la plante pour limiter les dommages du stress hydrique. En règle générale, les plantes qui accumulent de fortes concentrations de solutés organiques présentent une plus grande tolérance au stress hydrique que les plantes qui accumulent des quantités négligeables [6]. L’accumulation de solutés permet notamment un ajustement osmotique qui est considéré comme une réponse adaptative majeure des végétaux exposés à un stress hydrique. Le BABA permet également d’induire une diminution du potentiel osmotique (PO). Cette diminution n’est pas corrélée à l’accumulation des solutés organiques. Ainsi, après 48 H de traitement alors que l’accumulation de solutés est la plus importante, le PO n’est pas affecté. D’autres solutés doivent donc compenser l’accumulation des solutés organiques. La diminution du PO induite par le BABA est attribuée à la diminution du contenu en eau et est également considérée comme une réponse adaptative de la plante bien que celleci soit de faible amplitude. La comparaison entre la réorganisation du métabolome engendrée par le traitement BABA et par un choc osmotique léger a révélé de très fortes similitudes entre les deux conditions. D’autre part le suivi du statut hydrique a permis d’établir que le BABA induit une diminution de la teneur en eau des feuilles des plantes traitées. Ces deux résultats suggèrent la présence de mécanismes de signalisation communs entre les deux types de réponse et que le BABA permet d’induire un stress hydrique. Au final, il semblerait que le stress hydrique léger induit par le BABA est responsable de la réorganisation du métabolome et de la diminution du PO. Ces deux réponses considérées comme des réponses adaptatives de la plante permettraient d’induire une acclimatation de la plante et d’expliquer l’amélioration de la plante induite par le BABA. 10 15 mg de MS + 400 µl CH3OH + 200 nmoles adonitol + 200 µl CHCl3 + 400 µl H2O aliquote de 50 µl 10 min à 70°C à 950 rpm 5 min à 70°C à 950 rpm vortexer 20 sec filtrer sur 0,2 µm séché sur un speedvacum + 40 µl méthoxyamine hydrochloride (20 mg/ml dans pirydine) 2 H à 37°C à 950 rpm 30 min à 37°C à 950 rpm + 70 µl MSTFA transfert dans vial Analyses GCMS 1 H à T°C ambiante Culture hydroponique du lin et traitements Extraction et dérivation des métabolites pour les analyses GCMS Le lin oléagineux a été cultivé en hydroponie sur du milieu Hoagland [7] dans un phytotron à 21°C (±1°C) et à 70 % (±1 %) d’humidité relative. L’intensité lumineuse mesurée au niveau des cotylédons était de 80 µmoles de photons / m 2 / s. L’hémériopériode a été fixée à 16 H et la nyctipériode à 8 H. Après 14 jours de croissance, le BABA (10 mg /L) ou le PEG 8 000 était appliqué dans le milieu hydroponique. Analyses GCMS Analyses RMN L’extraction s’est réalisée à partir de 750 µL de CH 3 OHd 4 et 750 µL de D 2 O. Les spectres ( 1 HRMN) ont été enregistrés à 300 K à partir d’un spectromètre Bruker Avance de 600 MHz. Les analyse ont été réalisées sur un système DSQII GCMS (Thermofisher Scientific) avec une colonne TR5MS (5% phényl polysilphénylènesiloxane) de 30 m x 0,25 mm x 0,25 µm selon [8]. [1] Casa et al., Eur J Agro, 1999, vol. 11, pp. 26778 [2] Touré A et Xueming X, CRFSFS, 2010, vol.9, pp. 26169 [3] Cohen, Plant Dis, 2002, vol. 86, pp. 44857 [4] Jakab et al., Plant Physiol, 2005, vol.139, pp. 26774 [5] Macarisin et al., Plant Cell Environ, 2009, vol.32, pp 161231 [6] Ashraf et al., in Adv Agro, 2011, pp. 24996 [7] Hoagland et Arnon, Cal Agri Exp Sta, 1938, vol. 347, pp. 139 [8] Lisec et al., Nat. Biotechnol, 2006, vol.1, pp. 38796 Remerciements Merci aux régions Picardie et ChampagneArdenne ainsi qu’à l’entreprise Laboulet pour le financement de ces travaux et merci au RFMF pour le financement de ce colloque.