Strukturbiologie DOI: 10.1002/ange.201103980 Vorhersage der Ligandenerkennung in einem Geruchsrezeptor durch Kombination von ortsgerichteter Mutagenese und dynamischer Homologie-Modellierung** Lian Gelis, Steffen Wolf, Hanns Hatt, Eva M. Neuhaus und Klaus Gerwert* Das Riechsystem von Säugetieren nutzt eine große Familie von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs), um eine Vielzahl flüchtiger Liganden zu erkennen und zu unter- scheiden. Mehr als 350 menschliche Gene kodieren funktio- nale olfaktorische Rezeptoren (ORs), [1] die zur Familie der Klasse-A-GPCRs (Rhodopsin-ähnlichen GPCRs) gehçren. [2] Aufgrund der schwierigen funktionalen Expression von Ge- ruchsrezeptoren in heterologen Zellsystemen [3, 4] sind bislang nur wenige ORs charakterisiert worden. Die meisten ORs mit bekanntem Ligandenspektrum erkennen mehrere, strukturell ähnliche Duftstoffe. [5] Es wird vermutet, dass hypervariable Residuen in den sieben Transmembranhelices (7TM I-VII) die Basis für die Ligandenspezifität bilden. [6] Um die Selek- tivität von ORs verstehen zu kçnnen, müssen zunächst die räumlichen Eigenschaften der Liganden-Bindenische analy- siert werden. Hierzu wurden bisher verschiedene Ansätze genutzt: [7] Liganden-basierte Herangehensweisen, wie Phar- makophor-Modellierung oder quantitative Struktur-Aktivi- täts-Beziehung (QSAR), kçnnen Modelle der nçtigen Li- gandenstruktur für die Unterscheidung zwischen aktivieren- den und inaktiven Liganden liefern und ermçglichen dadurch Rückschlüsse auf die Form der Bindetasche. [8–11] Rezeptor- basierte Ansätze, wie Homologie-Modellierung, generieren ein detailliertes Modell des Proteins und der Bindetasche und geben auf diese Weise Informationen über die Ligandenbin- dung. [12–18] Beide Techniken kçnnen auch kombiniert werden. [19–22] Für solche Rezeptor-basierten und kombinier- ten Ansätze stehen bislang Rçntgenstrukturen von sieben GPCRs zur Verfügung, [23–32] es konnte jedoch noch keine Rçntgenstruktur eines OR gelçst werden. Frühere Studien erstellten basierend auf den Strukturen von Rhodopsin [12–21] und dem b 2 -adrenergen Rezeptor (B2AR) [33] statische Strukturmodelle von verschiedenen ORs. Da Duftstoffe aber oftmals hochflexible Verbindungen sind, ist zu vermuten, dass die Erschließung der Dynamik des Protein/Ligand-Komple- xes essenziell für das Verständnis der Ligandenerkennung in Geruchsrezeptoren sein kçnnte. Deshalb untersuchten wir die der Rezeptoraktivierung zugrunde liegende dynamische Interaktion zwischen Ligand und Protein, anstatt die Ligan- denbindung in statischen Modellen zu analysieren. Im Un- terschied zu anderen Studien über flexible GPCR-Bindeta- schen [34–37] nutzten wir die Vorhersagekraft von Moleküldy- manik(MD)-Simulationen [38–40] zur Untersuchung des Prote- in/Liganden-Komplexes. In dieser Studie entwickelten wir ein dynamisches Modell des funktional gut charakterisierten Riechrezeptors hOR2AG1. [41] Die Startstruktur für die dynamische Homo- logie-Modellierung von hOR2AG1 war die Rçntgenstruktur von Rinderrhodopsin [24] mit einer Auflçsung von 2.2 , da beide Rezeptoren den Klasse-A-GPCRs angehçren und beide hydrophobe Liganden binden. Dieser Ansatz wurde bereits durch die auf einer Rhodopsinstruktur basierende Homologie-Modellierung der B2AR-Liganden-Bindenische getestet (siehe Abschnitt 1a der Hintergrundinformatio- nen). [40] Die negativen Auswirkungen der relativ geringen Sequenzübereinstimmungen innerhalb der Klasse-A-GPCRs [*] Prof. Dr. K. Gerwert [+] Lehrstuhl für Biophysik, Ruhr-Universität Bochum Universitätsstraße 150, 44780 Bochum (Deutschland) E-Mail: gerwert@bph.ruhr-uni-bochum.de Homepage: http://www.bph.ruhr-uni-bochum.de/ Dr. S. Wolf, [+] Prof. Dr. K. Gerwert [+] Department of Biophysics, CAS-Max-Planck Partner Institute for Computational Biology, Shanghai Institutes for Biological Sciences 320 Yue Yang Road, 200031 Shanghai (V.R. China) Dr. L. Gelis, [+] Prof. Dr. H. Hatt Lehrstuhl für Zellphysiologie Ruhr-Universität Bochum (Deutschland) Prof. Dr. E. M. Neuhaus [+] Neuroscience Research Center, Cluster of Excellence NeuroCure, CharitØ-Universitätsmedizin Berlin CharitØplatz 1, 10117 Berlin (Deutschland) [ + ] L.G. und S.W. trugen in gleichem Maße zur Bearbeitung des For- schungsthemas, E.M.N. und K.G. in gleichem Maße zur Betreuung der Studie bei. [**] Wir danken H. Bartel und J. Gerkrath für technische Unterstützung, W. Zhang (Pharmaceutical Product Development, Inc., Beijing) für ihre Beteiligung bei Pilotexperimenten für diese Studie und J. Panten (Symrise, Holzminden) sowie T. Gerke (Henkel, Düsseldorf) für die Bereitstellung von Duftstoffen. Rechnungen wurden auf dem PICB HPC Cluster durchgeführt. Wir danken dem NIC Jülich (Pro- jekt-Nr. hbo26) und dem RRZ Kçln für die Bereitstellung von zu- sätzlicher Rechenkapazität und U. Hçweler für Diskussionen. Mo- lekulare Darstellungen wurden mit PyMol (DeLano Scientific) er- stellt. Diese Studie wurde durch Forschungsgelder der DFG an E.M.N., H.H. und K.G. (SFB642), der Ruhr-University Research School und der Ruth und Gerd Massenberg Stiftung unterstützt. S.W. wird durch ein CAS Young International Scientist Stipendium finanziert. E.M.N. wird von Exc 257 NeuroCure finanziell unter- stützt. K.G. erhält Fçrderung durch die Mercator Stiftung. L.G. führte experimentelle Untersuchungen durch, S.W. führte theoreti- sche Untersuchungen durch. H.H., E.M.N. und K.G. leiteten die Forschung. Alle Autoren schrieben das Manuskript. Hintergrundinformationen zu diesem Beitrag (Details zu Zellkultur- und Transfektionstechniken, Western Blot, Einzelzell-Ca 2+ -Imaging, Mutagenese durch Overlap-Extension-PCR und Klonierung, Immunzytochemie, Computer-Modellierung von hOR2AG1 und MD-Simulationen) sind im WWW unter http://dx.doi.org/10.1002/ ange.201103980 zu finden. . Angewandte Zuschriften 1300  2012 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim Angew. Chem. 2012, 124, 1300 –1304