ZUSCHRIFTEN Angew. Chem. 2001, 113, Nr. 10  WILEY-VCH Verlag GmbH, D-69451 Weinheim, 2001 0044-8249/01/11310-1941 $ 17.50+.50/0 1941 Durch Fluoreszenz-Fingerprinting zu molekularen Erkennungslandschaften** Manfred Auer,* Christine Graf und James J. La Clair* Die Zahl verschiedener Moleküle, die in einem einzigen Experiment untersucht werden können, hat sich im letzten Jahrzehnt drastisch erhöht. Dieser Fortschritt ermöglicht es nun, molekulares Material in einem noch nie dagewesenen Umfang zu testen, was nicht zuletzt maûgeblich dazu bei- getragen hat, solch groû angelegte Projekte wie die Sequen- zierung des Genoms von mehr als 30 Organismen durch- zuführen. [1] In der nächsten Entwicklungsstufe müssen diese Fortschritte nun in ein gängiges Format überführt werden, um so ein vorhandenes Medium für Informationen auf moleku- larer Ebene zu erweitern. Mit bis zu 10 6 erfassten molekularen Erkennungsereignissen sind Techniken wie die DNA-Mikro- arrays [2] bereits im Begriff, dieses Niveau zu erreichen. Dagegen bestehen noch beträchtliche Hürden, mit diesen und ähnlichen mehrdimensionalen Techniken einzelne mole- kulare Spezies in einer Ansammlung von strukturell und/oder biophysikalisch ähnlichen Molekülen zu identifizieren. Mehrdimensionales Testen (Screening) von molekularen Wechselwirkungen ist heute dank der Entwicklung folgender Techniken möglich: 1) räumlich adressierbare Mikroarrays, [2] 2) empfindlichere Sensoren (z. B. Einzelmolekülspektrosko- pien), [3] 3) molekulares Codieren, [4] 4) ¹molekulare Nasenª [5] und/oder 5) Mikroroboter. [6] Derzeit basiert ein wesentlicher Teil der Testmethoden auf fluoreszenzspektroskopischer Detektion. Dabei werden in der Regel stationäre (steady- state) fluoreszierende Proben untersucht (d. h. Verbindungen, die wegen ihres starren Gerüsts bei minimaler Abhängigkeit von der Wellenlänge maximal fluoreszieren). Das Fluorophor 1 hingegen kann wegen der Rotations- möglichkeiten um sechs seiner Bindungen eine Vielzahl an Konformationen sowohl im Grund- als auch im angeregten Zustand einnehmen. [7] Jede dieser Konformationen weist einen anderen Konjugationsgrad auf und erhöht damit die Informationsdichte in den Absorptions- und Emissionsspek- tren. Die komplexe Photophysik dieses Systems [8] bietet also einen wesentlich gröûeren Informationsgehalt als traditionel- le starre Fluorophore wie Fluorescein und Rhodamin. Die Einschränkung des Komformationsraums um 1 bei Wechselwirkung mit der Oberfläche anderer Moleküle oder Molekülgruppen kann den Übergang in bestimmte Charge- Transfer-Zustände oder Konformere beeinträchtigen und damit die photophysikalische Antwort verringern. [8] Dies kann genutzt werden, um molekulare Erkennungsereignisse zu identifizieren. Wir zeigen hier, wie mit diesem Werkzeug niedrigaffine molekulare Wechselwirkungen erkannt und unterschieden werden können. Als Modellsystem wurde eine typische Klasse von Kohlenhydrat-Protein-Wechselwirkun- gen herangezogen. Agglutinine von Lens culinaris (LCA), [9] Galanthus nivalis (GNL) [10] und Pisum sativum (PSA) [11] erkennen a-Manno- side, [12] nicht jedoch b-Glucoside. Die Lectine LCA und PSA sind zu 91 % homolog und haben ähnliche dreidimensionale Strukturen. Beide sind homodimere Proteine, die aus einer a- und einer b-Kette bestehen. Wie bei anderen Leguminose- Lectinen erstrecken sich zwei groûe antiparallele b-Faltblät- ter über das gesamte Dimer, wobei ein Calcium- und ein Manganatom in der Nähe der Kohlenhydrat-Erkennungs- stelle lokalisiert sind. [9, 11] Die dimeren LCA- und PSA- Komplexe enthalten vier mögliche Bindungsstellen für Koh- lenhydrate. Im Gegensatz zu LCA und PSA gehört das tetramere GNL zur Überfamilie der a-d-Mannose-spezifischen pflanzlichen Bulbus-Lectine ± einer Gruppe von Molekülen, die Retro- viren sehr gut inhibieren. Die Kristallstrukturanalyse dieses Lectins im Komplex mit Methyl-a-d-mannose ergab eine neuartige b-Faltblatt-Polypeptidstruktur mit dreizähliger Symmetrie. Drei antiparallele, viersträngige b-Faltblätter, von denen jedes eine konservierte Mannose-Bindungsstelle enthält, sind zu einem zwölfsträngigen b-Zylinder zusammen- gefasst. Mittels C-terminalem Strangaustausch bilden jeweils Paare von Monomeren stabile Dimere. Die daraus resultie- renden b-Faltblatthybride sind die eigentlichen Stellen für das hochaffine Binden von Mannose im Bereich der Dimer- [*] Univ.-Doz. Dr. M. Auer, C. Graf Allergic Diseases Unit Fluorescence based HTS-Technology Program Novartis Forschungsinstitut GmbH Brunner Straûe 59, 1235 Wien (Österreich) Fax: ( 43) 1-86634-727 E-mail: manfred.auer@pharma.novartis.com Dr. J. J. La Clair Bionic Brothers Postfach 511107, 13371 Berlin (Deutschland) E-mail: bionicbros@yahoo.com [**] J.J.L. dankt Wolfgang Rettig (Humboldt-Universität) für seine Groû- zügigkeit während der Erstellung dieses Manuskripts und der Uebbing Foundation für ihre Unterstützung. M.A. dankt Jan E. de Vries für stete Förderung und Unterstützung.