TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 51-57 51 CHỌN DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN KERATINASE TRONG ESCHERICHIA COLI BL21(DE3) TỪ VI KHUẨN BACILLUS Nguyễn Thu Hiền 1 , Hoàng Thị Thu Hiền 1 , Khuất Hữu Thanh 2 , Nguyễn Huy Hoàng 1* 1 Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam, *nhhoang@igr.ac.vn 2 Trường ại học Bách khoa Hà Nội TÓM TẮT: Bacillus licheniformis và Bacillus subtilis là hai chủng vi khuẩn có khả nng thủy phân lông v cao. Protein keratinase từ hai chủng này đã được nghiên cứu khá phổ biến, đây là nhóm enzyme thương mại, có nhiều ứng dụng quan trọng trong các ngành công nghiệp, trong các quá trình công nghệ sinh học liên quan đến chất thải có chứa keratin từ ngành công nghiệp gia cầm và công nghệ da. Mặt khác, keratin sau khi bị thủy phân có thể làm thức n chn nuôi, phân bón, keo, tạo ra được các axit amin hiếm như serine, cystein và proline và góp phần giảm thiểu ô nhiễm môi trường. Nhằm mục đích thu được lượng enzyme có hoạt tính cao, chúng tôi tiến hành biểu hiện gen keratinase tái tổ hợp từ B. licheniformis và B. subtilis trong Escherichia coli. Gen Ker 1 từ chủng B. licheniformis HT10 được tích hợp vào vector pET22b và gen Ker 2 từ B. subtilis .nđ1.2 được tích hợp vào vector pET32a. Trong cùng điều kiện biểu hiện ở 37 o C, cảm ứng IPTG nồng độ 1mM, hai protein thu được có kích thước và hoạt độ enzyme khác nhau lần lượt là 28 kDa, 23,5 U/ml và 36 kDa, 18,5 U/ml. Từ khóa: Bacillus lichenniformis, Bacillus subtilis, E. coli, biểu hiện gen, keratinase. MỞ ẦU Keratin là thành phần chủ yếu trong lông v, là protein cấu trúc sợi, giàu liên kết disulfide, hydro và các đầu tương tác kị nước dẫn đến độ bền cơ học cao. Theo Lin et al. (2009) [6], keratin không hòa tan trong nước và không phân hủy bởi các enzyme phân giải protein phổ biến như trypsin, pepsin và papain. Nhưng keratin có thể bị phân hủy bởi các vi sinh vật có khả nng sinh keratinase cao. Hiện nay, keratinase được thu từ nhiều nguồn khác nhau như nấm, xạ khuẩn, vi khuẩn. Trong nhóm vi khuẩn có khả nng sinh keratinase, hoạt tính keratinase cao đã được ghi nhận rộng rãi đối với các chủng từ Bacillus. Keratinase có đặc tính sinh hóa rất đa dạng khi được thu từ các nguồn khác nhau. Mặc dù chỉ phân lập trong phạm vi hai chủng vi khuẩn B. licheniformis và B. subtilis nhưng cng cho ta thấy sự đa dạng của keratinase. ối với B. licheniformis, theo nghiên cứu của Lin et al. (1992) [7], keratinase có khối lượng phân tử 33 kDa, pH tối ưu đã được xác định 7.5, nhiệt độ tối ưu là 50°C và ổn định khi bảo quản ở -20°C. ối với chủng B. subtilis, keratinase có khối lượng phân tử là 25,4 kDa, pH tối ưu là 7,5 và nhiệt độ tối ưu là 70°C theo công bố của Gupta & Ramnani (2006) [2]. Nhiều nghiên cứu ghi nhận rằng keratinase được phân lập từ chủng B. licheniformis và B. subtilis, là thành viên của nhóm protease serine, điều này đã được đề cập đến trong công bố của Brandelli (2008) [1]. ây là nhóm enzyme thương mại, có nhiều ứng dụng quan trọng trong các ngành công nghiệp, trong các quá trình công nghệ sinh học liên quan đến chất thải có chứa keratin từ ngành công nghiệp gia cầm và công nghệ da. Mặt khác keratin sau khi bị thủy phân có thể làm thức n chn nuôi, phân bón, keo, tạo ra các axit amin hiếm như serine, cystein và proline, làm giảm ô nhiễm môi trường [9]. Do tầm quan trọng của keratinase trong các ngành công nghiệp, keratinase đã được nghiên cứu khá nhiều. Nhưng để đáp ứng nhu cầu ngày càng tng của keratinase trong ứng dụng công nghiệp, những nghiên cứu tập trung vào việc nâng cao nng suất và hoạt tính keratinase thông qua nhân bản gen và biểu hiện keratinase tái tổ hợp. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nhân đoạn gen mã hóa keratinase bằng phản ứng PCR từ 2 chủng vi khuẩn B. licheniformis và B. subtilis, chọn dòng trong hệ vector pET và biểu hiện trong vi khuẩn E. coli. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu