EFECTO DE LA TEMPERATURA EN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA α-L-FUCOSIDASA DE THERMOTOGA MARITIMA Y EN LA SÍNTESIS DE FUCO-OLIGOSACÁRIDOS Monica Robles-Arias, Sergio Alatorre-Santamaría, Francisco Guzmán-Rodríguez, Lorena Gómez-Ruiz, Gabriela Rodríguez-Serrano, Mariano García-Garibay, Alma Cruz-Guerrero. Dpto. de Biotecnología, Universidad Autónoma Metropolitana Unidad Iztapalapa. C.P. 09340. C.P. 52006 E-mail: mroblesarias@xanum.uam.mx Introducción. Los oligosacáridos de la leche humana (OLH) están formados por el disacárido lactosa al que se unen unidades de D-glucosa, D-galactosa, ácido siálico, L-fucosa y N-acetilglucosamina (1). Los fuco-oligosacáridos (FUCOS) son los OLH más abundantes al encontrarse en una concentración de 2.43±0.26 g/L (2); además aportan beneficios a la salud de los recién nacidos al ejercer efecto prebiótico, ayudar al desarrollo del cerebro, contra patógenos, etc. (3). En la Figura 1 se observa que al incrementar la temperatura aumenta la actividad hidrolítica de la α- L-fucosidasa de T. maritima presentando la máxima actividad a 95 °C. Palabras clave: Fuco-oligosacáridos, α-L-fucosidasa, Thermotoga maritima Metodología. El efecto de la temperatura en la actividad hidrolítica se cuantificó a 50-95 °C, empleando 4-nitrofenil α-L- fucopiranosido (pNP-Fuc) 3.5 mM en buffer de fosfatos (0.1 M pH 8) y 0.0065 U/ml de α-L-fucosidasa de T. maritima. La actividad se midió espectrofotométricamente por la liberación de pNP a 410 nm. El efecto de la temperatura sobre la síntesis de FUCOS se determinó empleando pNP-Fuc 3.5 mM, lactosa 438 mM en buffer de fosfatos (0.1 M pH 8) y 0.0065 U/ ml de α-L-fucosidasa de T.maritima. La reacción se incubó a 60-90 °C por 10-60 minutos y agitación orbital constante. La actividad hidrolítica se midió por la liberación de pNP a 410 nm y los FUCOS sintetizados se cuantificaron por HPLC. Los FUCOS pueden ser sintetizados enzimáticamente mediante α- L-fucosidasas (E.C. 3.2.1.51) las cuales son exo- glicosidasas que presentan doble actividad catalítica, hidrólisis y transferencia, donde la selectividad de la enzima está determinada por el medio de reacción (4). Figura 1. Efecto de la temperatura en la actividad hidrolítica de α-L- fucosidasa Figura 2. Efecto de la temperatura en la síntesis de FUCOS Conclusiones. A mayor temperatura se sintetizó una mayor concentración de FUCOS, coincidiendo con la mayor actividad enzimática. Bibliografía 1. Gudiel-Urbano M. & Goñi I. (2001). Arch. Latinoam. Nutr. 51:332–339. 2. Rudloff S. & Kunz C. (2013) Adv. Nutr. 3:398S–405S. 3. Bode, L. (2015). Early Hum. Dev. 91:619–622. 4. Sulzenbacher G. et al. (2004). J. Biol. Chem. 279:13119– 13128. 5. Warmerdam A. et al. (2013). J. Agric. Food Chem. 61: 6458– 6464. Está investigación se realizó gracias al apoyo En la Figura 2 se muestra que al aumentar la temperatura se sintetiza una mayor concentración de FUCOS. El incremento de la temperatura de 60 a 90 °C permitió aumentar la síntesis de 0.37 a 0.76 mM. Resultados similares fueron obtenidos por Warmerdam et al (5) quienes al emplear una β-galactosidasa de Bacillus circulans y elevar la temperatura de 25 a 60 °C incrementaron la síntesis de galacto-oligosacaridos de 25 a 100 g/L respectivamente. El objetivo de este proyecto fue evaluar el efecto de la temperatura en la actividad hidrolítica de la α-L-fucosidasa de Thermotoga maritima y en la síntesis de FUCOS. 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 50 60 70 80 90 100 Vo (mg/min.ml) Temperatura (°C) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 0 10 20 40 60 FUCOS (mM) Tiempo (min) 60 °C 70 °C 80 °C 90 °C Resultados. Es conocido que la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas se incrementa con la temperatura en el intervalo en que la enzima es estable y permanece activa.