Characterization of antibodies specific for the caspase cleavage site on poly(ADP-ribose) polymerase: specific detection of apoptotic fragments and mapping of the necrotic fragments of poly(ADP-ribose)polymerase Frédéric R. Sallmann, Sylvie Bourassa, Jérôme Saint-Cyr, and Guy G. Poirier Abstract: Intracellular cysteine proteases are important mediators of apoptosis. Indeed, some nuclear proteins and enzymes are cleaved during apoptosis, in particular poly(ADP-ribose) polymerase (PARP), which is activated by DNA strand interruptions and is involved in DNA repair. PARP is cleaved into two fragments of 29 and 85 kDa (apparent molecular mass) in human promyelomonocytic leukemia cells, HL-60, treated with etoposide to induce apoptosis. These cells possess protease activities, caspases, that share many features with the ICE/CED-3 family. The cleavage occurs between Asp-214 and Gly-215, a site that is conserved in human, bovine, and chicken PARP. This cleavage has been shown to be an early marker of apoptosis. To monitor apoptosis, to understand the role of PARP cleavage by caspases, and to study the role of the two fragments in DNA repair, members of our laboratory have developed two polyclonal antipeptide antibodies directed against the two human PARP sequences: [196–214] for LP96-22 and [215–228] for LP96-24. Moreover, these antibodies will be useful to map the necrotic cleavage of PARP, which generates fragments different from those obtained during apoptosis, and thus to discriminate between apoptotic and necrotic cell death. Key words: poly(ADP-ribose) polymerase, antibodies, apoptosis, necrosis. Résumé : Les cystéine-protéases intracellulaires sont d’importants médiateurs de l’apoptose. En effet, des protéines et des enzymes nucléaires sont scindées au cours de l’apoptose, en particulier la poly(ADP-ribose) polymérase (PARP), qui est activée par des bris d’ADN et qui intervient dans la réparation de celui-ci. La PARP est scindée en deux fragments de 29 et 85 kDa (masse moléculaire apparente) dans les cellules promyélomonocyto-leucémiques humaines, HL-60, incubées en présence d’étoposide afin d’induire l’apoptose. Ces cellules ont des activités de caspases, des protéases ayant plusieurs caractéristiques des enzymes de la famille des ICE/CED-3. Le clivage se produit entre les résidus Asp-214 et Gly-215, un site conservé dans la PARP de l’Homme, du boeuf et du poulet. Ce clivage est un marqueur précoce de l’apoptose. Afin de suivre le déroulement de l’apoptose, de comprendre le rôle du clivage de la PARP par des caspases et d’étudier le rôle des deux fragments dans la réparation de l’ADN, notre laboratoire a produit deux anticorps polyclonaux dirigés contre deux séquences peptidiques de la PARP humaine : le LP96-22 dirigé contre la séquence [196–214] et le LP96-24 dirigé contre la séquence [215–228]. En outre, ces anticorps seront utiles pour établir le profil de clivage de la PARP au cours de la nécrose, un processus produisant des fragments différents de ceux générés durant l’apoptose permettant ainsi de distinguer la mort cellulaire par apoptose de la mort cellulaire par nécrose. Mots clés : poly(ADP-ribose) polymérase, anticorps, apoptose, nécrose. [Traduit par la rédaction] Received April 2, 1997. Revised August 15, 1997. Accepted September 18, 1997. Abbreviations: caspase, cysteine aspartate protease; cyt B, cytochalasin B; DBD, DNA binding domain; DMSO, dimethylsulfoxide; MAP, multiple antigenic peptide; PARP, poly(ADP-ribose) polymerase; VP-16, etoposide. F. R. Sallmann and J. Saint-Cyr. Health and Environment Unit, CHUL Research Center, CHUQ, Pavillon CHUL, Ste-Foy, QC G1V 4G2, Canada. S. Bourassa and G.G. Poirier. 1 Health and Environment Unit and Eastern Quebec Peptide Sequencing Facility, CHUL Research Center, CHUQ, Pavillon CHUL, Ste-Foy, QC G1V 4G2, Canada. 1 Author to whom all correspondence should be sent at the following address: Unité santé et environnement, Room 9700, CHUQ, Pavillon CHUL, 2705, boulevard Laurier, Ste-Foy, QC G1V 4G2, Canada. e-mail: guy.poirier@crchul.ulaval.ca Biochem. Cell Biol. 75: 451–456 (1997) 451 © 1997 NRC Canada