Medizinische Chemie DOI: 10.1002/ange.200704594 Sensibilisierte Detektion inhibitorischer Fragmente und iterative Ent- wicklung nicht-peptidischer Proteaseinhibitoren durch dynamisches Ligationsscreening** MarcoFlorianSchmidt,AlbertIsidro-Llobet,MichaelLisurek,AdeebEl-Dahshan,JinzhiTan, RolfHilgenfeldundJörgRademann* ProfessorGüntherJungzum70.Geburtstaggewidmet Gewöhnlich werden biologisch aktive, Wirkstoff-ähnliche kleine Moleküle durch Hochdurchsatzscreening chemischer Bibliotheken identifiziert. Zusammenstellung und Durch- musterung großer chemischer Bibliotheken sind jedoch zeit- aufwändig und kostspielig. Der Erfolg dieses Ansatzes hängt stark von der Qualität der verfügbaren Bibliotheken ab, und selbst die größte Bibliothek kann immer nur einen winzigen Ausschnitt des virtuellen chemischen Raumes abdecken. Aus diesen Gründen wurde im Verlauf der letzten zehn Jahre eine Reihe von Strategien vorgeschlagen, die allesamt das Ziel verfolgen, den Entwicklungsprozess zu erleichtern, indem das Zielprotein als eine Schablone für den Aufbau von Liganden verwendet wird. [1–3] Die Bindung niedermolekularer Frag- mente kann durch die NMR-Spektroskopie [2a–b] oder Rönt- genkristallographie [2c–d] direkt detektiert werden. Diese bio- physikalischen Methoden lieferten in einigen Fällen Ligan- den niedriger Affinität, die als rationale Startpunkte für die schrittweise Entwicklung potenter Protein bindender Mole- küle fungierten. Alternativ dazu wurden Proteinliganden aus Gemischen von Molekülen identifiziert, die sich in einem dynamischen Gleichgewicht befanden. In Gegenwart des Proteins wurde das Gleichgewicht verschoben, die am besten bindenden Produkte wurden in dem Gemisch angereichert und konnten durch Chromatographie, Massenspektrometrie oder NMR-Spektroskopie nachgewiesen werden. [3a,b] Alle bisherigen Fragment-basierten Methoden haben gemeinsam, dass sie lediglich die Bindung, nicht die biologische Aktivität von Molekülen detektieren. Darüber hinaus erfordern alle diese Methoden große Proteinmengen und haben den Nachteil einer schwierigen, zeitaufwändigen und teuren De- tektion der aktiven Verbindungen. Wir hatten die Idee, dass eine erheblich empfindlichere Detektion der bioaktiven Liganden realisierbar sein sollte, wenn reversibel gebildete Ligationsprodukte im dynamischen Gleichgewicht mit einem fluorogenen Reportersubstrat um ein Enzym konkurrieren (Abbildung 1). Dieser Ansatz würde die dynamische, Protein-unterstützte Bildung der inhibitori- schen Molekülspezies und die Detektion durch Fluoreszenz- screening-Techniken kombinieren – deshalb benannten wird ihn „dynamisches Ligationsscreening“ (DLS). Im DLS-Ver- fahren sollten chemisch reaktive Inhibitoren als dirigierende Sonden verwendet werden können und eine Testung von in- hibitorischen Fragmenten für einen definierten Bindungsort auf der Proteinoberfläche ermöglichen. Eine enzymatische Reaktion könnte die Signale zur Detektion bindender Frag- mente verstärken und dadurch die erforderliche Protein- menge drastisch reduzieren. Schließlich sollte die enzymati- sche Detektion durch fluoreszierende Reportermoleküle das Hochdurchsatzscreening (HTS) in Mikrotiterplatten (MTPs) ermöglichen, sodass erstmals konventionelle HTS-Techniken in der Fragment-basierten Ligandenentwicklung eingesetzt werden könnten. Wir haben die SARS-Coronavirus-Hauptprotease (SARS-CoV M pro ; SARS = schweres Atemwegssyndrom, severe acute respiratory syndrome) als Zielprotein ausge- wählt, um die Anwendung der DLS-Methode zu demon- strieren. SARS-CoV M pro ist eine Cysteinprotease, die für die Replikation des Virus innerhalb der infizierten Wirtzellen essenziell ist. Daher wurde sie als ein Wirkstoffziel zur Be- [*] M. F. Schmidt, A. Isidro-Llobet, Dr. M. Lisurek, A. El-Dahshan, Prof. Dr. J. Rademann Leibniz-Institut für Molekulare Pharmakologie (FMP) Robert-Rössle-Straße 10, 13125 Berlin (Deutschland) Fax: (+ 49)309-406-2981 E-Mail: rademann@fmp-berlin.de Homepage: http://www.fmp-berlin.de/rademann.html M. F. Schmidt, Prof. Dr. J. Rademann Institut für Chemie und Biochemie, Freie Universität Berlin Takustraße 3, 14195 Berlin (Deutschland) A. Isidro-Llobet Institut für Biomedizinische Forschung Science Park, Universität Barcelona Josep Samitier 1–5, 08028 Barcelona (Spanien) Dr. J. Tan, Prof. Dr. R. Hilgenfeld Institut für Biochemie, Zentrum für Struktur- und Zellbiologie in der Medizin, Universität Lübeck Ratzeburger Allee 160, 23538 Lübeck (Deutschland) [**] Wir danken Samuel Beligny, Angelika Ehrlich, Franziska Hinterleit- ner, Dagmar Krause, Jörn Saupe, Bernhard Schmikale und Walter Verheyen für technische Unterstützung sowie Jeroen R. Mesters und Koen H. Verschueren für Diskussionen. Die Arbeit am FMP wurde durch die DFG (Ra 895/2-5), die Regierung von Katalonien (Sti- pendium an A.I.L.) und durch Boehringer Ingelheim Pharma un- terstützt. Die Arbeit an der Universität Lübeck wurde durch die DFG (Hi 611/4-1), den Innovationsfond Schleswig-Holstein, das Deutsch-Chinesische Zentrum für Forschungsförderung Bejing (GZ 233-202/6) und die Europäische Kommission durch das SEPSDA Projekt (SP22-CT-2004-003831) gefördert. J.R. und R.H. danken dem FCI für Unterstützung. Hintergrundinformationen zu diesem Beitrag sind im WWW unter http://www.angewandte.de zu finden oder können beim Autor angefordert werden. Angewandte Chemie 3319 Angew. Chem. 2008, 120, 3319 –3323 # 2008 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim