Histidinphosphorylierung DOI: 10.1002/ange.201003965 Nachweis und Identifizierung von Protein-Phosphorylierungen in Histidinen mithilfe von HNP-Korrelationen** Sebastian Himmel, Sebastian Wolff, Stefan Becker, Donghan Lee* und Christian Griesinger* Zelluläre Prozesse und Kommunikationsvorgänge werden durch posttranslationale Modifikationen wie Proteinphos- phorylierungen reguliert. Hierbei spielt die Phosphorylierung von Histidinresten eine sehr wichtige Rolle. [1, 2] Aufgrund der Instabilität der N-P-Bindung bei niedrigen pH-Werten und der beiden möglichen Phosphorylierungsstellen im Imid- azolring ist die Histidinphosphorylierung trotz erheblicher Fortschritte bei der Entwicklung biophysikalischer Metho- den, wie Kernresonanzspektroskopie (NMR) und Massen- spektrometrie, am schwierigsten zu charakterisieren. Erst durch kürzlich erzielte Verbesserungen in der Probenvorbe- reitung für massenspektrometrische Analysen gelang es überhaupt, Phosphohistidine nachzuweisen. [3–5] Trotz alledem liefert die Massenspektrometrie derzeit keine Informationen, mit deren Hilfe sich die Regiochemie der Histidinphos- phorylierung aufklären ließe. Nach wie vor ist eine genaue Identifizierung des phos- phorylierten Stickstoffatoms (N d1 oder N e2 ) im Imidazolring der Phosphohistidine sehr zeitintensiv, mit hohem experi- mentellen Aufwand verbunden oder noch nicht genügend ausgereift. In Massenspektren weist ein Massenverlust von 80 Da ( ÀPO 3 H À ) auf das Vorhandensein von Phosphohisti- dinen hin, [4] ermöglicht aber keine Unterscheidung zwischen den beiden potenziell phosphorylierten Stickstoffatomen. Bei phosphorylierten Proteinen liefert der Vergleich von chemi- schen Verschiebungen für 31 P aus 1D-Spektren oder chemi- sche Verschiebungen für 15 N aus 2D- 1 H, 15 N-Korrelations- spektren [6–10] mit entsprechenden Referenzsubstanzen, bei- spielsweise chemisch phosphoryliertem Histidin, nur bedingt eindeutige Ergebnisse, selbst unter Bedingungen, bei denen das Protein denaturiert ist. [11] Prinzipiell kann man die Re- giochemie bestimmen, indem man die pH- und temperatur- abhängigen Hydrolysegeschwindigkeiten der N-P-Bindung mit Werten für freie Phosphohistidine vergleicht. [12, 13] Aller- dings können sich diese Hydrolysegeschwindigkeiten von Phosphohistidinen in Proteinen aufgrund der chemischen Umgebung von denen freier Phosphohistidine unterschei- den. [14] Außerdem erfordern der Nachweis des hydrolysierten Phosphats sowie dessen Präparation und Quantifizierung zusätzliche Experimente, z.B. eine chromatographische Auf- trennung radioaktiv markierten Phosphats ( 32 P). [14] Somit steht derzeit keine zuverlässige und schnelle analytische Methode zur Bestimmung der Regiochemie von phosphory- lierten Histidinen zur Verfügung. Für NMR-Spektroskopiker ist es naheliegend, phos- phorylierte Stickstoffatome direkt mithilfe von 15 N, 31 P-Kor- relationsspektren über skalare Kopplung ( 1 J( 15 N, 31 P)) zu identifizieren und über unterschiedliche Korrelationsmuster die Regiochemie der Histidinphosphorylierung aufzuklären, ohne dabei auf die Interpretation chemischer Verschiebungen angewiesen zu sein. Die sequenzielle Zuordnung der Histi- dine kann über NOESY- oder CC-TOCSY-Experimente [15] erfolgen. Während Experimente vom hier beschriebenen HNP-Typ für andere Kernkombinationen schon verwendet worden sind, ist das von uns vorgestellte Experiment bisher noch nicht in der Literatur beschrieben, was möglicherweise auf die stark variierende Größe der skalaren Kopplungs- konstanten von Phosphor-Stickstoff-Verbindungen zurück- zuführen ist. [16] Selbst für Phosphohistidine sind keine Kopplungskonstanten publiziert. Daher haben wir zunächst die Kopplungskonstanten 1 J( 15 N, 31 P) in Phosphohistidinen gemessen. Auf der Grundlage dieser Werte wurde das er- wähnte HNP-Experiment entworfen, das direkt Histidin- phosphorylierungen nachweist und aufgrund der charakte- ristischen, von der chemischen Verschiebung unabhängigen Korrelationsmuster die Regiochemie eindeutig anzeigt. Magnetisierung kann von 1 H zu 31 P in Phosphohistidinen mithilfe skalarer Kopplungen zwischen 1 H und 15 N( 2 J( 1 H, 15 N) und 3 J( 1 H, 15 N)) sowie zwischen 15 N und 31 P( 1 J( 15 N, 31 P)) für alle Arten phosphorylierter Histidine transferiert werden. Im Spektrum zeigen sich ein, zwei oder drei Kreuzsignale zwi- schen 1 H und 31 P für die Phosphohistidine 1, 2 bzw. 3 (Ab- bildung 1). Die einzige Voraussetzung ist, dass die Effizienz des 1 J( 15 N, 31 P)-Transfers möglichst unabhängig von der Art des Phosphorylierungsmusters ist. Um die charakteristischen und für die Regiochemie spezifischen Korrelationsmuster zu erhalten, nutzten wir die großen Unterschiede der skalaren Kopplungen zwischen 1 H und 15 N( 2 J( 1 H, 15 N) und 3 J( 1 H, 15 N)). Die signifikant kleinere Kopplungskonstante 3 J( 1 H, 15 N) (À2 Hz) verglichen mit 2 J( 1 H, 15 N) in Histidin (À5 bis À10 Hz) bewirkt einen deutlich weniger effizienten Magnetisierungs- transfer, sodass die Intensität der 3 J( 1 H, 15 N)-vermittelten Kreuzsignale um einen Faktor 6 bis 20 schwächer ist als die der 2 J( 1 H, 15 N)-vermittelten Kreuzsignale. [6, 17] Dadurch ist es möglich, die Phosphorylierungszustände anhand individueller [*] S. Himmel, S. Wolff, Dr. S. Becker, Dr. D. Lee, Prof. Dr. C. Griesinger Abteilung für NMR-basierte Strukturbiologie Max-Planck-Institut für biophysikalische Chemie Am Fassberg 11, 37077 Göttingen (Deutschland) Fax: (+ 49) 551-201-2202 E-Mail: dole@nmr.mpibpc.mpg.de cigr@nmr.mpibpc.mpg.de [**] Diese Arbeit wurde von der Max-Planck-Gesellschaft unterstützt. Wir danken Dr. S. Hübner und Prof. Dr. J. Stülke, Institut für Mi- krobiologie und Genetik der Universität Göttingen, für Bakterien- klone mit EI-, HPr- und GlcT-Plasmid-DNA. Weiterhin danken wir Dr. M. Sabo und Prof. Dr. J. Stülke für die kritische Lektüre dieses Manuskripts. Hintergrundinformationen zu diesem Beitrag sind im WWW unter http://dx.doi.org/10.1002/ange.201003965 zu finden. Angewandte Chemie 9155 Angew. Chem. 2010, 122, 9155 –9158  2010 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim