ETUDE PAR SPECTROMETRI E DE MASSE DE PROTEI NES I NTERVENANT ETUDE PAR SPECTROMETRI E DE MASSE DE PROTEI NES I NTERVENANT DANS LA REPONSE AU STRESS OXYDANT PAR LES PEROXYDES CHEZ LA DANS LA REPONSE AU STRESS OXYDANT PAR LES PEROXYDES CHEZ LA LEVURE LEVURE D. PFLIEGER 1 , A. DELAUNAY 2 , M.-B. BARRAULT 2 , M. TOLEDANO 2 , J. VINH 1 , J. ROSSIER 1 . 1 Neurobiologie et Diversité Cellulaire, ESPCI, CNRS UMR 7637, 75231 Paris Cedex 05 2 Laboratoire Stress Oxydants et Cancers, Service de Biochimie et de Génétique Moléculaire, Département de Biologie Joliot Curie, DSV/CEA-Saclay, Gif-sur-Yvette, 91191 CEDEX INTRODUCTION INTRODUCTION La concentration intracellulaire en peroxydes doit être finement contrôlée pour préserver l’intégrité de la cellule. Ce contrôle homéostatique est assuré par des voies métaboliques spécialisées, qui sont activées en réponse à de faibles variations de la concentration en peroxydes. Chez Saccharomyces cerevisiae, Yap1 est un facteur de transcription qui joue un rôle primordial dans la réponse au stress oxydant par les peroxydes. L’activité de Yap1 est essentiellement contrôlée par sa localisation subcellulaire. En l’absence de stress, Yap1 est cytoplasmique car il est exporté rapidement du noyau par le récepteur nucléaire Crm1/Xpo1. Lorsque les cellules sont exposées à des peroxydes, Yap1, oxydé, n’est plus reconnu par ce récepteur nucléaire, et se concentre de ce fait dans le noyau. Il induit alors la majorité des activités antioxydantes de la cellule. L’export nucléaire de Yap1 est contrôlé par son état d’oxydation (Delaunay et al, 2000). En présence de peroxyde d’hydrogène (H 2 O 2 ), Yap1 se lie de façon transitoire avec une protéine de 20 kDa par un pont disulfure intermoléculaire. Le partenaire de Yap1 a été identifié par LC-MS/MS comme étant une glutathione peroxydase : Gpx3. L’étude de souches mutantes de levure a révélé que Gpx3 constitue probablement le premier maillon du système de détection du peroxyde d’hydrogène chez la levure et transmet ce signal de stress oxydant à Yap1. La liaison covalente de Yap1 et de Gpx3 est essentielle à l’oxydation de Yap1 en un pont disulfure intramoléculaire, la forme active de ce facteur. En effet, le changement de conformation induit par cette modification prévient l’export de Yap1 hors du noyau en inhibant son interaction avec l’exportine Crm1. Des analyses par spectrométrie de masse en tandem sur un appareil nanoESI-Q-TOF ont permis de préciser les mécanismes moléculaires aboutissant à l’activation de Yap1, en identifiant les résidus cystéines impliqués : 1) dans l’association covalente entre Yap1 et le détecteur Gpx3 ; 2) dans la forme oxydée active de Yap1. Ces identifications, confirmant des résultats prédits par la génétique, ont permis de proposer un mécanisme singulier de transduction /détection d’un stress par les peroxydes, reposant sur la détection et transmission d’un signal redox par une peroxydase. Memento Memento Yap1 est une protéine de 72,5 kDa, possédant 6 cystéines aux positions 303, 310, 315, 598, 620 et 629. Gpx3 est une protéine de 18,6 kDa, possédant des cystéines aux positions 36, 64 et 82. Yap1 C303A désigne le mutant de Yap1 où la cystéine 303 a été remplacée par une alanine MATERIEL ET METHODES MATERIEL ET METHODES Echantillons protéiques Les protéines extraites de la souche de levure S. cerevisiae YPH98 (Sikorski et Hieter, 1989) (MATa, ura3-52, lys2-801 amber , ade2-101 ochre trp1-∆1 leu2-∆1) et de mutants ont été purifiées et séparées par électrophorèse sur gel selon les méthodes préalablement décrites (Delaunay et al, 2000 et soumis). La protéine recombinante Myc-Yap1 correspondant à la protéine Yap1 marquée par 9 épitopes Myc en son extrémité N-terminale a été purifiée à l’aide de l’anticorps monoclonal anti-Myc 9 E10. Analyses LC-MS/MS et MS/MS Les protéines séparées sur gel SDS-PAGE ont été digérées par la trypsine, d’après le protocole de Shevchenko et al. (1996). La moitié de chaque échantillon a été réduite et alkylée par le dithiothréitol (DTT) et l’iodoacétamide avant la digestion enzymatique. Pour identifier Gpx3, le produit de digestion de la bande de gel correspondant à Yap1 C303A associé à son partenaire a été analysé par chromatographie capillaire en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS), à l’aide d’un système chromatographique Famos-Switchos-UltiMate (LC Packings, Amsterdam, Pays-Bas) connecté à un spectromètre de masse hybride nanoESI-QqTOF (QTOF2, Micromass, Manchester, Royaume-Uni). Les séparations chromatographiques ont été menées sur une colonne capillaire à polarité de phase inversée (Pepmap C18, 75 µm d.i., 15 cm de longueur, LC Packings), à un débit de 200 nL/min, avec un gradient de 100% de tampon A (H 2 O/acétonitrile/AF, 96/4/0,1, v:v) à 50% de tampon B (H 2 O/acétonitrile/AF, 10/90/0,085, v:v) en 50 min, suivi par 15 min à 100% B. Les données de LC-MS/MS ont été obtenues en mode automatique et converties en fichiers .PKL grâce au logiciel Masslynx (Micromass), puis soumises au programme de recherche Mascot (http://www.matrixscience.com/ ). Les protéines ont été identifiées par confrontation des données expérimentales à la banque de données NCBInr. Pour identifier les ponts disulfures, les peptides tryptiques des protéines Yap1 et Gpx3 ont été analysés par fragmentation manuelle en spectrométrie de masse en tandem sur le QTOF2. Des ions de masses correspondant aux peptides liés par un pont disulfure ou à leurs constituants réduits et alkylés ont été détectés, sélectionnés et fragmentés. Figure 2 : (a) protéines identifiées par le programme Mascot à partir des données LC- MS/MS obtenues avec la bande de gel Myc- Yap1 C303A + partenaire. (b) Spectre MS/MS permettant d’identifier le partenaire de Yap1 comme étant Gpx3. 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 M/ z 0 100 % K Y VP D E N G G N V D 506,27 y4 229,11 b1 310,17 y2 978,45 y9 621,31 y5 921,40 y8 864,36 y7 1092,44 y10 1191,50 y11 1306,51 y12 Myc-Yap1 C303A + partenaire protéique d’environ 20 kDa Myc-Yap1 C303A Figure 1 : migration de Myc- Yap1 C303A sur gel non réducteur 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 M/z 0 100 % S G P S-H 2 O V 316,14 b3 291,16 y2 1121,49 y11 415,20 b4 567,23 y5 696,33 y6 1024,48 y10 880,43 y8 967,39 y9 1289,60 y13 1190,52 y12 1388,63 y14 201,12 b2 514,2 7 b5 V 767,2 8 y7 L A E E F SL D V V (b) Spectres mal interprétés par le programme Spectres mal interprétés par le programme Mascot Mascot : Identification du partenaire protéique de Yap1 par LC Identification du partenaire protéique de Yap1 par LC-MS/MS. MS/MS. Yap1 interagit de façon covalente avec une protéine de 20 Yap1 interagit de façon covalente avec une protéine de 20 kDa kDa : : Gpx3 Gpx3 La reprise manuelle de spectres mal interprétés par Mascot a permis de repérer : • des peptides correspondant aux épitopes Myc, • le peptide 279-305 de Yap1 contenant la mutation Cys303Ala. • le peptide 611-626 de Yap1 où la Cys 620 est alkylée par le NEM, non proposé comme modification dans Mascot. • le peptide 9-25 de Yap1 phosphorylé sur la sérine S 14 (figure 3). Le précurseur sélectionné porte une modification de 79,97 Da par rapport à la séquence peptidique 9-25 théorique. La perte de phosphorylation par la sérine S 14 est repérable sur le spectre de fragmentation : ce résidu apparaît comme une déhydroalanine (Ser-H 2 O), de masse 69,02 Da. (a) Après extraction protéique de cellules de levure traitées au peroxyde d’hydrogène (H 2 O 2 ), l’immunoprécipitation de la protéine Myc-Yap1 a permis d’isoler une deuxième espèce protéique. La révélation de cette protéine par Western blotting avec l’anticorps anti-Myc montre qu’il s’agit de Myc-Yap1 associé à une protéine d’environ 20 kDa. Myc-Yap1 associé à son partenaire apparaît en quantité moins importante que Myc-Yap1 seul (Figure 1). L’étude de la souche sauvage et des différents mutants de Yap1 (mutations ponctuelles de chaque cystéine) montre que cette protéine est la plus présente dans la souche mutante Yap1 C303A . Yap1 : 40% de couverture de séquence protéique (16 peptides différents fragmentés) Gpx3 = Hyr1 : 27% de couverture de séquence (peptides 26-35, 96-108, 142-160). La figure 2b représente le spectre MS/MS du peptide 96-108 de Gpx3 ayant contribué à son identification. Figure 3 : spectre de fragmentation d’un peptide phosphorylé de Yap1 obtenu en analyse LC-MSMS automatique Modèle de mécanisme de réponse au stress oxydant proposé Modèle de mécanisme de réponse au stress oxydant proposé Hypoth Hypothèse d se d’un pont un pont disulfure disulfure intramol intramoléculaire entre les cyst culaire entre les cystéines 303 et 598 de Yap1 confort ines 303 et 598 de Yap1 confortée par analyse MS/MS. e par analyse MS/MS. REFERENCES REFERENCES Delaunay, A., Isnard A.-D. et Toledano, M. EMBO J. 2000 Oct 2;19(19):5157-66. Sikorski, R. S., et Hieter, P. (1989). Genetics 122, 19-27. Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., et Mann, M. (1996). Anal Chem 68, 850-858. Mise en évidence du pont intermoléculaire Yap1 Mise en évidence du pont intermoléculaire Yap1-Gpx3 Gpx3 SH 36 64 82 SOH 36 SH SH 303 598 H 2 O 2 SH 303 598 36 303 598 H 2 O Trx red Trx ox Gpx3 red Yap1 red SH SH Gpx3 ox S S S S Figure 4 : modèle de mécanisme proposé pour l’oxydation de Yap1 Le mécanisme d’activation de Yap1 (figure 4) a été proposé suite à des études génétiques effectuées antérieurement chez des souches mutantes de levure. Les données obtenues par spectrométrie de masse ont permis de confirmer et de renforcer les interprétations basées sur ces expériences de génétique. Lors de la purification de la protéine Myc-Yap1, les cellules de levure sont en présence de NEM, de sorte que les cystéines libres sont modifiées par cet agent alkylant. La figure (6a,b) représente le spectre MS/MS obtenu lors de la fragmentation des espèces à m/z = 517,2(2+) dans le produit de digestion de la forme réduite de Yap1. Les deux peptides isobares 306-313 et 598-604 (M = 1032,45 Da et 1032,43 Da), contenant Cys 310 et Cys 598 alkylées par le NEM, ont pu être mis en évidence. Dans la forme oxydée de Yap1 digéré par la trypsine, la fragmentation des ions à m/z = 517,2(2+) ne permet de révéler que le peptide 306-313, contenant Cys 310 alkylée par le NEM (Figure 6c). Le pont disulfure supposé entre les cystéines 303 et 598 de la forme oxydée de Yap1 n’a pas pu être révélé de façon directe. En revanche, lorsque la forme oxydée de Yap1 a été préalablement réduite et alkylée par l’iodoacétamide avant la digestion tryptique, le peptide 598-604, avec Cys 598 alkylée par l’iodoacétamide, a pu être détecté et fragmenté (Figure 6d). Les cystéines 310, 315 et 620 de Yap1 ont été détectées sous forme alkylée par le NEM dans la forme oxydée de Yap1. Ces trois cystéines ne semblent donc pas impliquées dans un pont disulfure. En revanche, Cys 598 formerait un tel pont d’après les résultats présentés figure 6. Les cystéines 629 et 303 n’ont pu être détectées. Le plus petit peptide tryptique contenant Cys 303 est de masse supérieure à 3,2 kDa ; cette masse élevée peut expliquer la non détection d’un peptide contenant Cys 303 . Yap1 ox Figure 5 : Fragmentation d’un peptide de masse M = 1847,8 Da, sous forme trichargée, correspondant aux peptides 598-604 de Yap1 et 36-43 de Gpx3 liés par un pont disulfure. Les séquences des deux peptides peuvent être lues sur le spectre. 616,94 = [M+3H] 3+ 616,94 = [M+3H] 3+ 943,46 0 100 % Yap1 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 M/z R D W I E S C 476,25 y3 175,13 y1 290,17 y2 589,34 y4 718,38 y5 805,43 y6 908,45 y7 Gpx3 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 M/z 0 100 % K Y Q P T F G C 535,32 y4 147,12 y1 310,19 y2 840,47 y7 438,25 y3 636,37 y5 783,45 y6 y8 598 CSEIWDR 604 36 CGFTPQYK 43 (a) (a) 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000 1050 1100 M/z 0 100 % R D W L E S Cys-NEM 175,13 y1 159,11 W 517,24 = [M+2H] 2+ 476,27 y3 290,18 y2 589,37 y4 718,43 y5 805,47 y6 M+H (d) (d) 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000 M/z 0 100 % R D W I E S Cys-Carba 175,11 y1 290,13 y2 483,20 = [M+2H] 2+ 476,19 y3 589,26 y4 805,32 y6 718,30 y5 M+H (b) (b) 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000 1050 1100 M/z 0 100 % R T G 175,13 y1 333,22 y3 902,51 15 % V Q N M 517,24 = [M+2H] 2+ 561,30 y4 660,38 y5 y7 Cys-NEM M+H 788,45 y6 (c ) (c ) 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000 1050 1100 M/ 0 100 % V Q N M M+H 299,05 175,12 y1 517,21 = [M+2H] 2+ 561,22 y4 788,37 y6 660,30 y5 902,67 y7 R 333,15 y3 T G Cys-NEM z Figure 6 : spectres MS/MS de peptides tryptiques de Yap1 permettant de repérer les cystéines 310 et 598 modifiées par l’agent alkylant NEM ou iodoacétamide. CONCLUSION CONCLUSION La spectrométrie de masse a permis de préciser les mécanismes moléculaires déclenchés chez la levure lors d’un stress oxydant par les peroxydes. En présence d’hydroperoxyde, Yap1, facteur de transcription qui active les fonctions antioxydantes de la cellule, s’associe à un partenaire protéique. L’analyse par LC-MS/MS du produit de digestion de Yap C303A lié à son partenaire a permis d’identifier ce dernier comme étant la thiol peroxydase Gpx3. Cette analyse a aussi révélé que Yap1 C303A , lié à Gpx3, était partiellement phosphorylé sur sa sérine 14. D’autre part, des analyses par spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) ont permis de localiser : 1) le pont disulfure intermoléculaire liant Yap1 à Gpx3 ; 2) de conforter l’hypothèse d’un pont intramoléculaire entre les cystéines 303 et 598 de Yap1. La connaissance du mécanisme de réponse au stress oxydant pourrait être approfondie par : 1) l’étude détaillée des modifications post-traductionnelles de Yap1 et de Gpx3 en fonction de leur état d’oxydation (notamment les phosphorylations) ; 2) l’analyse du produit de digestion de Yap1 oxydé par une autre enzyme que la trypsine, afin de valider la présence du pont disulfure intramoléculaire entre les cystéines 303 et 598.