Effects of bone morphogenetic protein-2 on bone cells in primary culture: Immunohistochemical and electronmicroscopical studies Wirkungen von BMP-2 auf Knochenzellen in Prima È rkulturen: Immunhistochemi- sche und elektronenmikroskopische Untersuchungen I. Schmitz 1 , N. Prochnow 1 , M. Wiemann 3 , K. Schirrmacher 3 , K. M. Mu È ller 1 , W. Sebald 2 and D. Bingmann 3 Bone morphogenetic protein 2 (BMP-2), among other morpho- genetic effects on non osseous tissues, promotes bone formation in vivo. Therefore, BMP-2 may accelerate the integration of osseous implants. Although the effects of BMPs on cell proliferation have been studied extensively in vivo or in cell lines, little is published about effects on bone cells in primary cultures, especially on cell differentiation. As such information is a prerequisite to understand and to control effects of BMPs on cells at the surface of implant materials, the present experiments aimed to describe effects of BMP-2 on primary cultures derived from calvarial fragments of neonatal rats. The cells were stimulated with 50 nM BMP-2 added to the nutrient medium for 3 or 6 days. Light- and electronmicros- copical studies showed that cells in the sprouting zones were larger and more often spindle shaped. Stimulated cells had more nucleoli than control cells and the endoplasmic reticulum was widened. They retained properties of typical bone cells: An immunhisto- chemical analysis showed that stimulated cells increased the activ- ity of alkaline phosphatase, they secreted collagen type I and to a minor extent collagen type III. In BMP-2 treated cells the pattern of cells stained for actin, desmin and vimentin hardly changed whereas extracellular fibronectin appeared to be less cross-linked in BMP-2 treated cultures. The distribution and labeling strength of osteocalcin, a specific marker protein of bone cells did not change markedly. After exposure to BMP-2 cells tended to detach from the cover slips. Electron microscopy showed a reduced number of cell processes possibly facilitating the detachment and/or mobility. Sti- mulated cells contained an increased number of lamellar bodies which may reflect an increased synthesis and/or membrane turn- over. Staining of non-osseous cells with anti-CD68- or anti-myeloid antibodies revealed that the small percentage of these cells regu- larly occurring in primary cultures was not changed after a 3 days lasting stimulation with BMP-2. Bone-morphogenetisches Protein 2 (BMP-2) fo Èrdert Differenzie- rung und Wachstum in fast allen Geweben. Am bekanntesten ist seine stimulatorische Wirkung auf die Knochenneubildung. Daher ist es naheliegend, BMP-2 auch fu Èr eine beschleunigte Osteointe- gration von Implantaten einzusetzen. Zahlreiche Untersuchungen in vivo und an Zelllinien haben die Wirksamkeit von BMP-2 auf die Zellproliferation ergeben. Effekte von BMP-2 sind aber kaum in Prima Èrkulturen von Knochenzellen untersucht worden, in denen die Differenzierung von unterschiedlichen Zelltypen eher als in Zelllinien u Èberpru È ft werden kann. Da solche Informatio- nen aber eine Voraussetzung fu Èr das Versta Èndnis und die Kontrolle von Zellreaktionen auf der Implantatoberfla Èche sind, wurde in den vorliegenden Untersuchungen die Wirkung von BMP-2 (50 nM) auf Prima Èrkulturen gepru Èft, die aus Kalvarienbruchstu Ècken neuge- borener Ratten gezu Èchtet wurden. Dabei wurden die Zellen fu Èr 3 oder 6 Tage mit BMP-2 stimuliert, das dem Na Èhrmedium zugesetzt war. Licht- und elektronenmikroskopische Untersuchungen zeig- ten, dass BMP-behandelte Zellen in der Aussprossungszone gro Èûer und ha Èufiger spindelfo Èrmig waren. Daru Èber hinaus hatten stimu- lierte Zellen mehr Nukleoli als die Kontrollzellen und ihr endoplas- matisches Retikulum war geweitet. Dennoch behielten die stimu- lierten Zellen Eigenschaften von Knochenzellen. Eine immunhisto- chemische Analyse zeigte, dass BMP-2-stimulierte Zellen die Ak- tivita Èt ihrer alkalischen Phosphatase steigerten und weiterhin Kol- lagen Typ I sowie zu einem geringen Teil Kollagen Typ III sezer- nierten. Der Gehalt an Actin, Desmin und Vimentin war in BMP- stimulierten Kulturen kaum vera Èndert. Fibronektin-positive Struk- turen erschienen weniger vernetzt. Die Osteocalcin-Verteilung bzw. Fa Èrbeintensita Èta Ènderte sich nach BMP-Einwirkungen nicht erkenn- bar. Nach der Stimulation lo Èsten sich vermehrt Zellen von den Deckgla Èschen ab. Elektronenoptische Untersuchungen zeigten bei stimulierten Zellen eine Abnahme der Zellfortsa Ètze, was zu ei- ner gesteigerten Mobilita Èt der Zellen und einer gesteigerten Ablo È- sung beitragen ko Ènnte. Schlieûlich wiesen die stimulierten Zellen vermehrt Lamellenko Èrper auf, was Ausdruck einer gesteigerten Synthese und/oder eines erho Èhten Umsatzes von Membranmaterial sein ko Ènnte. Fa Èrbungen von nicht-ossa Èren Zellen mit anti-CD68- oder anti-myeloid Antiko È rpern zeigten, dass der geringe Anteil die- ser Zellen, die regelma Èûig in prima Èren Kulturen gefunden werden, nach einer 3-ta Ègigen BMP-2-Stimulation nicht vera Èndert war. 1 Introduction Insufficient and too slow osseointegration of implants like total hip replacements often cause problems especially in el- der patients. In the last decades mechanical and physicochem- ical properties of the implant materials were modified to ac- 1 Institut fu Èr Pathologie, Berufsgenossenschaftliche Kliniken Bergmannsheil, Bu Èrkle-de-la Camp Platz 1, 44789 Bochum 2 Institut fu Èr Physiologische Chemie II, Theodor-Boveri-Institut fu Èr Biowissenschaften (Biozentrum) der Universita Èt Wu Èrzburg, Am Hubland, 97074 Wu Èrzburg 3 Institut fu Èr Physiologie, Universita Èt Essen, Hufelandstr. 55, 45122 Essen 178 0933-5137/01/0202-0178$17.50  .50/0 Mat.-wiss. u. Werkstofftech. 32, 178±184 (2001) Ó WILEY-VCH Verlag GmbH, D-69451 Weinheim, 2001