Amyloidprotofibrillen DOI: 10.1002/ange.201007265 Festkörper-NMR-spektroskopische Untersuchungen an Ab-Proto- fibrillen: Nachweis einer Umgestaltung der b-Faltblätter bei der Ausreifung von Amyloidfibrillen** Holger A. Scheidt, Isabel Morgado, Sven Rothemund, Daniel Huster* und Marcus Fändrich* Die Amyloidfibrillen der Alzheimer-Krankheit werden hauptsächlich von den Peptiden Ab(1–40) und Ab(1–42) ge- bildet. [1] Während monomeres Ab(1–40) größtenteils un- strukturiert ist, [2] bedingt seine Aggregation zu Amyloidfi- brillen die Bildung von b-Faltblattstrukturen. Ausgereifte Amyloidfibrillen (MAFs) sind das Endprodukt des Fibrillie- rungsprozesses. Diese Fibrillen haben eine lange, gerade und hoch geordnete Gestalt (Abbildung 1 A). Die b-Faltblatt- struktur von MAFs konnte bereits mit Festkörper(FK)- NMR-Spektroskopie und anderen Methoden nachgewiesen werden. [3, 4] Die Bildung dieses Endzustandes der Fibrillierung verläuft über mehrere Zwischenzustände (Abbildung S1 in den Hintergrundinformationen), [5–7] zu denen kaum detail- lierte Strukturinformationen vorhanden sind. In der vorlie- genden Studie haben wir mit FK-NMR-Spektroskopie die b- Faltblattstruktur eines solchen Zwischenprodukts der Fibril- lierung – der Protofibrillen (PFs) – untersucht. Unsere Daten zeigen Strukturdetails der Amyloidogenese von Ab(1–40) und veranschaulichen die mit diesem speziellen Schritt ver- bundenen Konformationsänderungen. PFs sind eine zytotoxische Form von Ab und damit ein möglicher Verursacher von Alzheimer. [8] PFs wurden als früheste fibrilläre Aggregate der Ab-Amyloidogenese iden- tifiziert. [5] Ihre gekrümmte ungleichmäßige Gestalt unter- scheidet sie deutlich von den MAFs. [5, 6] PFs zeigen wenig Wechselwirkung mit den Farbstoffen Kongorot und Thiofla- vin T. [6] Dennoch haben PFs signifikante Anteile an b-Falt- blattstrukturen, wie mit Infrarotspektroskopie und Rönt- genbeugung gezeigt werden konnte. [9] Die hier vorgestellte Studie wurde durch die Stabilisie- rung der normalerweise metastabilen PFs mit dem aus einem Antikörper abgeleiteten Protein B10AP möglich (Abbil- dung S1 in den Hintergrundinformationen). [9] Insgesamt wurden acht Ab(1–40)-Peptide mit verschiedenen Isotopen- markierungen chemisch synthetisiert. Dabei decken die 15 N- und 13 C-Markierungen insgesamt 30 Aminosäuren (AS) aus allen Strukturregionen des Peptids ab (Abbildung S2 in den Hintergrundinformationen). Mit diesen Peptiden wurden anschließend die jeweiligen Proben von B10AP-stabilisierten Ab(1–40)-PFs in vitro hergestellt. Die Morphologie der PFs und die Probenhomogenität wurden mit Transmissions- Elektronenmikroskopie (TEM) überprüft; hierbei wurden keine nichtfibrillären Aggregate oder MAFs gefunden (Ab- bildung 1 B). In 13 C-CP-MAS-NMR-Spektren (CP = Kreuz- polarisation, MAS = Rotation um den magischen Winkel) und zweidimensionalen 13 C- 13 C-Korrelationsexperimenten wurden die NMR-Signale der markierten Aminosäuren in Ab (Abbildung S3 in den Hintergrundinformationen) aufge- zeichnet. Die Linienbreite der NMR-Signale betrug typi- scherweise zwischen 1.5 und 3.0 ppm. Alle 13 Ca- und 13 Cb- Signale konnten eindeutig zugeordnet werden (Tabelle S1 in den Hintergrundinformationen). Abbildung 2A zeigt die chemischen Verschiebungen von 13 Ca und 13 Cb, die besonders informativ bezüglich der Se- kundärstruktur sind, als Differenz zu den Random-Coil- Werten („Sekundärverschiebungen“). [10] In diesem Dia- gramm weisen alle AS (außer Gly) für eine b-Faltblattstruk- Abbildung 1. Elektronenmikroskopiebilder (Maßstabsbalken: 200 nm) von Ab(1–40) in 50 mm Hepes (pH 7.4) und 50 mm NaCl, 72 h inku- biert bei 37 8C A) ohne und B) mit B10AP. Molares Verhältnis 10:1 (Ab/B10AP). Hepes = 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethansulfon- säure. [*] Dr. H. A. Scheidt, Prof. Dr. D. Huster Institut für Medizinische Physik und Biophysik Universität Leipzig Härtelstraße 16–18, 04107 Leipzig (Deutschland) E-Mail: daniel.huster@medizin.uni-leipzig.de Dr. S. Rothemund Interdisziplinäres Zentrum für Klinische Forschung Universität Leipzig (Deutschland) Dr. H. A. Scheidt, Dr. I. Morgado Institut für Biochemie und Biotechnologie Martin-Luther Universität Halle-Wittenberg (Deutschland) Dr. M. Fändrich Max-Planck-Forschungsstelle für Enzymologie der Proteinfaltung und MLU Weinbergweg 22, 06120 Halle (Deutschland) E-Mail: fandrich@enzyme-halle.mpg.de [**] Diese Arbeit wurde unterstützt von der DFG (SFB 610 (A14, N01), einem DFG-Stipendium für I.M. und dem Exzellenznetzwerk Bio- wissenschaften (Sachsen-Anhalt). Wir danken der DFG und dem Institut für Experimentalphysik der Universität Leipzig für die Messzeit am Avance 750. Hintergrundinformationen zu diesem Beitrag sind im WWW unter http://dx.doi.org/10.1002/ange.201007265 zu finden. Angewandte Chemie 2889 Angew. Chem. 2011, 123, 2889 –2892  2011 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim