VALIDACION DE PCR PARA Listeria monocytogenes EN LECHES Edith Mariela Burbano1, Ana Karina Carrascal1, Marcela Mercado1, Raúl Poutou2. 1 Laboratorio de Microbiología de Ali- mentos. 2 Laboratorio de Biotecnología Aplicada. Grupo de Biotecnología Am- biental e Industrial. Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias. Pontificia Universidad Javeriana. Bogotá. D.C. acarrasc@javeriana.edu.co Número telefónico: 320 83 20 Ext. 4111. rp000274@javeriana.edu.co ó rpou- tou@hotmail.com Número telefónico: 320 83 20 Ext. 4024. RESUMEN El trabajo valida la técnica de PCR para la detec- ción rápida, sensible y confiable de Listeria mono- cytogenes en leches, detección basada en la es- pecificidad de los “primers” LI1 y U1 que recono- cen el género Listeria amplificando una banda de 938 pb producida por la hibridación con una se- cuencia específica de la región codificante del rDNA 16S y los “primers” LF y LR que reconocen el gen hlyA de L. monocytogenes amplificando una banda de 750 pb. La reproducibilidad cumplió con un Kappa de 0.85, sensibilidad y especifici- dad de 100% con un error Kappa de 0.15%, te- niendo como métodos de comparación un método inmunológico y el método tradicional. INTRODUCCIÓN L. monocytogenes se ha convertido en un proble- ma de salud pública. A pesar de que el número de personas afectadas por esta enfermedad es relati- vamente bajo en comparación con otras enferme- dades, la mortalidad es alta (30%). Entre las en- fermedades asociadas se encuentran: meningitis, encefalitis, septicemias, abortos. En Colombia en 1996 se realizaron estudios de incidencia de L.monocytogenes en leches, los resultados indica- ron 34% para leches crudas y 2% en leches pas- teurizadas. Estos porcentajes representan una alta incidencia de contaminación en comparación con estudios realizados por países industrializados como Holanda con un 4.4%, Francia con 4.6% y Estados Unidos un 12%. (Campos 1996). Actualmente, la identificación de L. monocytoge- nes se realiza por ausencia/presencia, con una duración promedio de 15 días, por lo que en la industria de alimentos este método no permite tomar decisiones rápidas, lo que incrementa el tiempo de liberación de los productos. En la actua- lidad se buscan técnicas rápidas y sensibles que permitan tomar decisiones a corto plazo. El objeti- vo de este trabajo fue validar la técnica de PCR para la detección de L.monocytogenes en leches crudas. MATERIALES Y MÉTODOS 2.1 Construcción de Bancos de Células Prima- rias (BCP): En este estudio se utilizaron 40 cepas (6 cepas de Listeria y 34 de otros géneros). (Ta- bla 1) Las cepas fueron preservadas en medio específico más glicerol al 30% y almacenadas a - 70ºC. 2.2. Extracción y cuantificación de DNA cro- mosomal Las cepas Gram negativas se cultiva- ron en caldo Luria Bertani y las Gram positivas en caldo Columbia durante 12 horas a 37°C y 250 r.p.m. La extracción se realizó según el método de Sambrook en 1989. 2.3. Electroforesis de DNA: El material de ex- tracción se separó electroforeticamente en gel de agarosa al 1% p/v preparado en tampón TAE 1X (40 mM Tris-acetato, 1mM EDTA pH 8), teñidos con bromuro de etidio (5μg/ml), a 120 voltios, 1h y fotografiados bajo luz ultravioleta. Como marcador de talla molecular se empleó 100 bp ladder (Gib- co BRL)” 2.4. Reacción de PCR: Se emplearon los inicia- dores, L1, U1 y LF, LR (Tabla2). La técnica de PCR se realizó en un volumen final de 50 μL, tampón de PCR 1X, 1.5 mM de MgCl 2 , 0.2 mM de cada dNTP, 10 pmol de cada iniciador y 2U de la DNA Polimerasa Taq, más 5 μL de DNA o mues- tra. Se empleó un termociclador programado de la siguiente manera: 1 minuto a 95 0 C, seguidos de 30 ciclos compuestos por 30 segundos a 94 0 C, 20 segundos a 51 0 C, 30 segundos a 72 0 C y un paso final de extensión de 8 minutos a 72 0 C ( Zamora 2000).