Regulated expression of HIV-1 Rev function in mammalian cell lines Lauren Swenarchuk, Penelope Harakidas, and Alan Cochrane Abstract: In order to facilitate further investigation of Rev function, we have generated two systems for the inducible expression of Rev in mammalian cell lines (HeLa and U937) using either a tetracycline-regulated promoter or fusion of Rev to a modified form of the hormone binding domain of the estrogen receptor. In the case of the fusion of Rev to the modified hormone binding domain of the estrogen receptor, we demonstrated induction of Rev function in response to tamoxifen administration to levels comparable to that of the unmodified Rev protein. Subsequently, U937 lines were generated that retained the observed pattern of hormone-dependent function of the Rev fusion protein. In the case of the tetracycline-regulated system, cell lines (both HeLa and U937) were generated that displayed tight regulation of Rev. In the case of the HeLa cell lines, they were used for the subsequent generation of stable cell lines expressing either HIV-1 env or chloramphenicol acetyl transferase (CAT) in a Rev-dependent fashion. Using the latter cell lines, we demonstrate the ability to control Rev expression over a broad concentration range and find that, as soon as Rev expression is detectable, induction of Rev-dependent gene expression is also observed. Key words: Rev, tamoxifen, tetracyline-regulated transcription, Rev function, threshold effects. Résumé : Pour faciliter les recherches ultérieures sur la fonction Rev, nous avons mis au point deux systèmes pour l’étude de l’expression inductible de Rev dans des lignées de cellules de mammifère (HeLa et U937) en utilisant soit un promoteur contrôlé par la tétracycline, soit la fusion de Rev à une forme modifiée du domaine de liaison à l’hormone du récepteur des œstrogènes. Dans ce dernier cas, soit la fusion de Rev au domaine modifié du récepteur, nous avons confirmé l’induction de la fonction Rev en réponse à l’administration de tamoxifène à des niveaux comparables à ceux obtenus avec la protéine Rev originale. Par la suite, nous avons obtenu des lignées U937 qui conservaient le profil de la fonction hormono-dépendante de la protéine de fusion Rev. Dans le cas du système contrôlé par la tétracycline, les deux lignées cellulaires (HeLa et U937) ont produit des cellules qui montraient une régulation serrée de Rev. Les lignées cellulaires HeLa ont servi par la suite à produire des lignées cellulaires stables exprimant soit HIV-1 env ou la chloramphénicol acétyl transférase (CAT) selon un mode Rev-dépendant. En utilisant ces lignées stables, nous avons confirmé la capacité de contrôler l’expression de Rev en présence d’un large spectre de concentrations et trouvé, qu’aussitôt que l’expression de Rev était détectable, l’expression du gène Rev-dépendant était aussi observable. Mots clés : Rev, tamoxifène, transcription contrôlée par la tétracycline, fonction Rev, effets à seuil. [Traduit par la Rédaction] Swenarchuk et al. 490 Introduction HIV-1 Rev plays a critical role in regulating the extent of viral replication within an infected cell, because of its abso- lute requirement for the synthesis of the viral structural pro- teins (Sodroski et al. 1986; Feinberg et al. 1986). Rev functions at the post-transcriptional level to facilitate the transport of unspliced and singly spliced viral RNAs from the nucleus to the cytoplasm (Felber et al. 1989; Malim et al. 1989b; Emerman et al. 1989; Hammarskjöld et al. 1989). In the absence of Rev, these viral RNAs are either sequestered in the nucleus or rapidly degraded (Felber et al. 1989; Malim et al. 1989b; Emerman et al. 1989; Hammarskjöld et al. 1989; Malim and Cullen 1993). Response to Rev is con- ferred by a 240 nt element, located within the env gene, des- ignated the Rev-responsive element (RRE) (Malim et al. 1989b; Rosen et al. 1988; Hadzopoulou-Cladaras et al. 1989). Subsequent work has demonstrated a direct interac- tion between Rev and RRE-containing RNA in vitro (Cochrane et al. 1990a; Zapp and Green 1989; Heaphy et al. 1990). Mutagenesis of Rev has defined two separate func- tional domains of the protein: (i) a.a. 8–68, which is required for interaction of Rev with the RRE, and (ii) a.a. 73–83, which corresponds to the transactivation domain of the pro- tein. The RRE-binding domain consists of a core RRE- binding domain (a.a. 35–51, which also contains the nuclear and nucleolar localization signals of the protein) (Perkins et al. Can. J. Microbiol. 45: 480–490 (1999) © 1999 NRC Canada 480 Received May 15, 1998. Revision received January 11, 1999. Accepted January 15, 1999. L. Swenarchuk and A. Cochrane. 1 Department of Medical Genetics and Microbiology, University of Toronto, Toronto, ON M5S1A8, Canada. P. Harakidas. Royal Victoria Hospital, Calcium Research Laboratory, 687 Pine Avenue West, Montreal, QC H3A 1A1, Canada. 1 Author to whom all correspondence should be addressed (e-mail: alan.cochrane@utoronto.ca).