INTERNATIONAL JOURNAL OF ONCOLOGY 5: 805-810, 1994 zyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLK Proliferation of diploid hepatocytes and nonparenchymal (oval) cells during rat liver regeneration in the presence of 2-acetylaminofluorene PER O. SEGLEN, GUNNAR SÆTER 1  and PER E. SCHWARZE 2  Department of Tissue Culture, Institute for Cancer Research, The Norwegian Radium Hospital, N-0310 Oslo, Norway  Received June 28, 1994; Accepted July 25, 1994  Abstract. Treatment of rats with the carcinogen 2- acetylaminofluorene (2-AAF) during liver regeneration (Solt- Farber protocol) induced a selective outgrowth of diploid,zyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA y- glutamyltranspeptidase (GGT)-positive hepatocytes (3-4  times increase) as well as of nonparenchymal (oval) liver  cells. After cessation of treatment the oval cells rapidly  disappeared, while the population of diploid, GGT-positive  hepatocytes declined more slowly over the subsequent ten  weeks. In animals pretreated with the initiating carcinogen  diethylnitrosamine (DEN) a large fraction of the diploid,  GGT-positive hepatocytes persisted. The results differ from  those obtained with our standard, sequential treatment  protocol (2-AAF given after completed regeneration), where  there is no hyperproliferation of oval cells and where GGT- positive hepatocytes are found only in DEN-pretreated  animals (Sæter et al, Carcinogenesis 9: 581-587, 1988).  Different experimental models of liver carcinogenesis may  thus present different patterns of liver cell proliferation,  which should be taken into account when general hypotheses  on the cellular origin of liver cancer are proposed.  Introduction Recent studies of rat liver carcinogenesis have suggested that  hepatocellular tumours may originate either from hepatocytes  Correspondence to: Professor Per O. Seglen, Department of  Tissue Culture, Institute for Cancer Research, The Norwegian  Radium Hospital, Montebello, N-0310 Oslo, Norway  Present address: 'Department of Oncology, The Norwegian  Radium Hospital, N-0310 Oslo; department of Environmental  Health, The National Institute of Public Health, N-0462 Oslo,  Norway  Abbreviations: 2-AAF, 2-acetylaminofluorene; DEN,  diethylnitrosamine; GGT, y-glutamyltranspeptidase; PH, partial  (2/3) hepatectomy  Key words: ploidy, flow cytometry, y-glutamyltranspeptidase,  differentiation, stem cell, oval cell, hepatocyte  or from a nonparenchymal cell type, the oval cells (1-5). The  latter are normally present in very small numbers in the  periportal region, surrounding bile duct termini (6). They  appear to have a condition-dependent capacity to  differentiate into bile duct cells as well as into hepatocytes,  and may be closely related to embryonic hepatoblasts (7-11).  In models of experimental liver carcinogenesis where 2- acetylaminofluorene (2-AAF) is applied as a promoter during  regenerative growth (the Solt-Farber protocol) (6,9) or in  combination with a choline-free diet (12), a massive  proliferation of oval cells and other non-parenchymal  elements accompanies the development of altered  hepatocellular lesions. In the Solt-Farber model, oval cell  proliferation is observed even without an initiating  carcinogen treatment (6). Apart from their characteristic  morphology (small, with oval nuclei), oval cells can be  recognized by the expression of marker enzymes like y- glutamyltranspeptidase (GGT) (12,13) or OV-6 (14), which  are not detectable in normal hepatocytes.  After initiation of carcinogenesis by non-necrogenic  doses of diethylnitrosamine (DEN), phenotypically altered  hepatocytes and hepatocellular foci, staining positively for  various marker enzymes, can be observed at very early time  points (15,16). Promotion with 2-AAF alone (i.e. without  concomitant regeneration or choline deficiency) strongly  stimulates the outgrowth of such DEN-initiated, GGT- positive hepatocytes (17), yet no unusual oval cell  proliferation is detected under these conditions. Both the  altered hepatocytes (18-21) and the later-appearing nodules  and carcinomas (22) are characterized by a largely diploid  growth pattern, in contrast to the polyploidizing growth of  normal liver tissue that causes the adult rat liver to be  predominantly tetraploid. Rat liver tumours induced by a  variety of carcinogenic regimens are predominantly diploid  (23-26), indicating that reduced polyploidization is a frequent  and characteristic feature of liver carcinogenesis. It has been  hypothesized that diploid cells may be more prone to  undergo mutations than polyploid cells and that they are  more likely to retain a high growth potential, otherwise lost  by irreversible polyploidization (18,22). Support for the latter  assumption has been obtained from studies of benign rat liver  nodules, the growth rates of which are inversely related to the  degree of polyploidy (22) and from rat hepatocellular  carcinomas, in which the proliferative activity of the various