Construction of an equalized cDNA library from Colletotrichum lagenarium and its application to the isolation of differentially expressed genes Atsuko Inagaki, Yoshitaka Takano, Yasuyuki Kubo, Kazuyuki Mise, and Iwao Furusawa Abstract: To establish an efficient screening system for differentially expressed genes of a phytopathogenic fungus Colletotrichum lagenarium, we constructed an equalized (normalized) cDNA library from C. lagenarium and used this library for differential screening. For the isolation of genes involved in infection-related developments of conidia, conidia undergoing appressorium differentiation were selected as the source of materials for construction of the cDNA library. The equalization of cDNA was performed twice using a kinetic method, and the products were cloned into a plasmid vector. Colony hybridization with nine probes of different abundance showed a reduction in abundance varia- tion from at least 276-fold in the original library to 10-fold in the equalized cDNA library, which demonstrated that the cDNA was successfully equalized. By differential hybridization of 1900 cDNA clones in the equalized cDNA library and RNA blot analysis of candidate clones, we identified 11 independent cDNA clones, designated CAD1 through CAD11, that were expressed in appressorium-differentiating conidia, but not in vegetative mycelia. The transcripts of CAD1 and CAD2 hardly accumulated in preincubated conidia, whereas those of CAD3 and CAD4 accumulated highly and slightly, respectively. The amount of the four CAD transcripts increased at the early stage of the appressorium for- mation process. Sequence analysis of CAD1 revealed that CAD1 would encode for 101 amino acid polypeptides, which showed homology to metallothioneins. Deduced amino acid sequence of CAD2 would encode 278 amino acid polypeptides, and showed high homology to genes in aflatoxin, and sterigmatocystin gene clusters of Aspergillus parasiticus and A. nidulans, respectively. Key words: equalized cDNA library, differential screening, Colletotrichum lagenarium, appressorium formation, CAD genes. Résumé : Nous avons construit une génothèque d’ADNc égalisé (normalisé) à partir du champignon Colletotrichum la- genarium dans le but de mettre au point un système efficace de criblage des gènes exprimés différemment chez ce champignon. Des conidies en processus de différentiation en hyphes applatis (appressoriums) ont servi de matériel de base dans la construction de cette génothèque d’ADNc pour l’isolement des gènes contrôlant les étapes de développe- ment reliées au processus infectieux des conidies. La normalisation des ADNc a été faite deux fois par une méthode cinétique et les produits ont été clonés dans un vecteur plasmidique. Une hybridation de colonies avec neuf sondes de différentes abondances a révélé une diminution de la variation de l’abondance d’au moins 276 fois dans la génothèque originale à 10 fois dans la génothèque d’ADNc normalisé, confirmant ainsi que l’ADNc était égalisé avec succès. Une hybridation différentielle de 1900 clones d’ADNc dans la banque d’ADNc normalisé et une analyse d’empreintes d’ARN de clones candidats nous a permis d’identifier 11 clones d’ADNc indépendants identifiés CAD1 à CAD11 qui étaient exprimés chez les hyphes se différenciant en appressoriums mais pas chez les hyphes végétatifs. Les copies de CAD1 et CAD2 s’accumulaient fortement dans les conidies préincubées tandis que les copies de CAD3 et de CAD4 s’accumulaient en grand et en petit nombre respectivement. Les quatre copies CAD augmentaient en nombre durant les premières étapes du processus de formation des appressoriums. L’analyse de la séquence de CAD1 suggère que le gène CAD1 coderait un polypeptide de 101 acides aminés présentant une homologie avec les métallothionéines. Selon la séquence obtenue, le gène CAD2 coderait un polypeptide de 278 acides aminés et il présente une forte homologie avec certains des gènes codant l’aflatoxine chez Aspergillus parasiticus et la stérigmatocystine chez A. nidulans. Mots clés : génothèque d’ADNc égalisé (normalisé), criblage différentiel, Colletotrichum lagenarium, formation d’appressoriums, gènes CAD. [Traduit par la Rédaction] Inagaki et al. 158 Can. J. Microbiol. 46: 150–158 (2000) © 2000 NRC Canada 150 Received June 21, 1999. Revision received October 4, 1999. Accepted October 5, 1999. A. Inagaki, Y. Takano, 1 K. Mise, and I. Furusawa. Laboratory of Plant Pathology, Graduate School of Agriculture, Kyoto University, Sakyoku, Kyoto, 606–8502, Japan. Y. Kubo. Laboratory of Plant Pathology, Faculty of Agriculture, Kyoto Prefectural University, Kyoto, 606–8522, Japan. 1 Author to whom all correspondence should be addressed (e-mail: ytakano@kais.kyoto-u.ac.jp).