INTERNATIONAL JOURNAL OF ONCOLOGY 8: 239-252, 1996 zyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONML Modification of growth related enzymatic pathways and apparent loss of tumorigenicity of azyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFED ras-transformed bovine endothelial cell line by treatment with 5-iodo-6-amino-l,2-benzopyrone (INH 2 BP) PALI. BAUER 1 ' 2 *, EVA KIRSTEN 1 *, LAWRENCE J.T. YOUNG 3 *, GYULA VARADI 2 , EVA CSONKA 2 ,  KALMANG. BUKI 1 , GABOR MIKALA 2 , RUIDE HU 3 , JOHN A. COMSTOCK 1 ,  JEROME MENDELEYEV 1 , ALAEDDIN HAKAM ' and ERNEST KUN 1  Laboratory of Environmental Toxicology and Chemistry and the Octamer Research Foundation, San Francisco State  University, Romberg Tiburon Centers, Tiburon, CA, 94920; department of Biochemistry II, Semmelweis University  Medical School, Budapest, Hungary;  3 Department of Pathology, School of Medicine, University of California,  Davis Medical Center, Sacramento, CA 95817, USA  Contributed by E. Kun, November 30, 1995  Abstract. Bovine aortic endothelial cells were converted to a  highly tumorigenic cell line by transfection with Ha-ras and  stimulation with thrombin. Sustained pretreatment with a  non-cytotoxic concentration (600 pJvl) of 5-iodo-6-amino- 1,2-benzopyrone (INH 2 BP), a lipophilic ligand of poly(ADP- ribose) polymerase, abrogatedzyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA in vivo tumorigenicity, of 10 5  cells per inoculum an effect which developed progressively  during 2 to 6 weeks of drug treatment. The initial action of  the drug was cytostasis, consisting of an arrest in prophase,  Correspondence to: Professor Ernest Kun, Laboratory of  Environmental Toxicology and Chemistry and the Octamer  Research Foundation, San Francisco State University, Romberg  Tiburon Centers, Tiburon, CA, 94920, USA  These authors contributed equally  Abbreviations: NH 2 BP, 6-amino-l,2-benzopyrone; INH 2 BP, 5- iodo-6-amino-l,2-benzopyrone; pADPRT, poly(ADP-ribose)  polymerase, E.C. 2. 4. 2. 30; ODC, L-ornithine decarboxylase;  PKC, protein kinase C; MAPK, mitogen-activated protein kinase;  DAG, diacyl glycerol; EM, electron microscopy; TBE, Tris-Borate- EDTA buffer; CIP, calf intestinal alkaline phosphatase; Topo I,  topoisomerase I; Topo II, topoisomerase II; MNNG, l-methyl-3- nitro-1-nitroso-guanidine; CHAPS, 3-[(3-chloroamidopropyl)- dimethylammonio]-l-propane-sulfonate; PMSF, phenylmethane- sulfonyl fluoride.  A preliminary symposium report of this work was presented at the  1st World Congress on Advances in Oncology, Oct. 22-26, 1995 in  Vouliagmeni, Athens, Greece, abstract No. 147.  Key words: ras gene, endothelial cell line, 5-iodo-6-amino-l,2- benzopyrone  extreme cell enlargement consistent with cytoplasmic  hypertrophy, as seen by EM, and dramatic morphologic  changes. Although neither DNA, RNA or protein syntheses  are directly affected by INH 2 BP, apparently newly synthesized  cellular DNA is degraded by endonucleases, which are up- regulated by the inhibition of their poly-ADP-ribosylation.  The drug treated cells exhibited greatly increased respiration  v  and aerobic glycolysis, due to an augmentation of glycolytic  and respiratory enzymes in enlarged cells. These responses to  the drug were reversible in cell cultures following drug  removal, within 5-10 days drug exposure but the progressive loss  of tumorigenicity in nude mice that developed after 3-6  weeks of drug exposure of cells, prior to inoculation to nude  mice, was not reversible in vivo. Drug treatment produced  a sustained 70-80% inhibition of pADPRT in intact cells at  600 \xM extracellular concentration of INH 2 BP. The  prerequisite for the abrogation of tumorigenicity was the  maintenance of pADPRT inhibition. The arrest of cell  multiplication and a large decrease of Topo I, especially of  Topo II and MAP kinase activities occurred without loss of  enzyme protein as assayed in cell extracts of drug-treated  cells. However INH 2 BP had no direct effect on these  enzymes. Drug treatment down-regulated DNA-methyl- transferase, PKC, ODC proteins, diminished cyclin A  protein, but the hypophosphorylated form of Rb protein was  significantly augmented. None of the enzymatic components  of signal pathways so far studied, were directly affected by  INH 2 BP. The inhibition of pADPRT by INH 2 BP coincided  with an induction or activation of alkaline phosphatase and  leucyl and glutamyl peptidase. The pADPRT content or the  expression of pADPRT gene were not influenced by drug  treatment, but the expression of ras gene was completely  absent in nontumorigenic drug-treated cells, without a loss of  ras gene from genomic DNA. Telomerase activity was not  directly influenced by INH 2 BP treatment when assayed in  diluted cell extracts, but the addition of homogeneous