Vol. 45 (1991) No. 6 ELISAfor the Detection ofWhite- and Brown-Rot Fungi 403 Holzforschung 45 (1991) 403-406 The Use of ELISA for the Detection of White- and Brown-Rot Fungi By Yoon Soo Kim 1 *, Jody Jellison 2) , Barry GoodelI 3) , ValerieTracy 3)  and Vikas Chandhoke 3) 1} Dept. of Forest Products & Technology, Chonnam National University, Kwangju 500-757, South Korea 2) Botany and Plant Pathology, College of Science, University of Maine, Orono, ME 04469, U.S. A. 3) Wood Science andTechnology, College of Forest Resources, University of Maine, Orono, ME 04469, US, A. Keywords ELISA Immuno-TEM Wood decay fungi Summary The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), a quantitative serological assay, was used to detect and quantify wood degrading fungal metabolites. Sensitivity and specificity of antibodies produced to Postiaplacenta, Coriolu$(Trametes) versicolor, Lentinus (Lentinula) edodes and Tyromyces palustris were also evaluated. ELISA procedural changes influenced both the sensitivity and specificity of the assay. Great sensitivity was seen in "non-sandwich" type assays. The ability of the assay to differentiate P. placenta from other fungal species was greater for "Sandwich" assays in which specific antibody has been conjugated directly to a detecting enzyme. Introduction Despite wide use of immunotechnology in the field of biology, its application to the study of wood decay fungi has only recently been investigated (e.g. Glancy et al 1990; Goodell et al 1988; Jellison and Goodell 1988, 1989; Palfreyman et al. 1988 a,b; Srebotnik and Messner 1990,1991). Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has been used to detect fungi in field crops (Johnson etaL 1981), and in woody twigs (Liese and Gotlieb 1982), at concentration äs low äs 100 ng/ml. Our previous studies have shown that the ELISA was a useful technique for the detection and quantification of decay fungi in culture and in wood (Daniel et aL 1988; Goodell and Jellison 1986; Jellison and Goodell 1988). Breuil et aL (1988 a,b) have used the assay for the detection of staining fungi in unseasoned wood. The purpose of the following investigations was to illustrate the feasibility of using ELISA to detect and quantify various lignocellulose degrading fungal metabolites and to evaluate the sensitivity and specific- ity of antibodies produced to four wood decay fungi. Material and Methods Antisera production and testing Extracellular culture fütrates were collected from 10-week-old cul· tures of the white-rot fungi Coriolus (Trametes) versicolor (L. ex Fr.) Pilat. and Lentinus (Lentinula) edodes (Berk,) Sing, and of the brown-rot fungi Postia placenta (Fr) Cke., Tyromyces palustris (Berk. et Curt) Murr,, grown in defined media.The extracellular metabolites in approximately 500 ml of filtrate for each fungus were ultrafiltered (molecular weight cutoff 10,000 Amicon YM 10) and concentrated at 5 ml.This material was then used äs the inject antl· gen in New Zealand white rabbits for antibody production,The ani- mals were boosted 3 times, at weekly intervals after the initial injec- tion. Blood samples were taken after 4 weeks and the polyclonal antisera purified using Standard procedures. The ELISA was run using a slightly modified variant (Jellison and Goodell 1988) ofthat previously described (Clark and Adams 1977). Dynatech Immulon 2 microtitre plates were incubated with test fungal antigens diluted in pH 9.6 Na-carbonate buffer for a minimum of 4 hours at 37°C. The plates were washed followed by a 1-hour blocking procedure in 2% fetal calf serum phosphate buffered saline (PBS) pH 74, before the test antisera were added in PBS pH 7.4 buffer Incubations were for a minimum of 4 hours at 37°C and overnight at 4°C Plates were subsequently washed and a detecting antibody conjugated to a specific enzyme to a specific enzyme tag (Sigma A-778 goat-anti rab- bit IgG alkaline phosphatase) added at a dilution of 1:500 in PBS buffer Plates were incubated 4 hours at 37°C, washed, and the en- zyme Substrate p-nitrophenol phosphatase was added to the plate weils at a concentration of Img/ml in diethanolamine pH 9.8 buffer. The intensity of the enzyme reaction was monitored äs a function of absorbance ranging from zero to a maximum of 1.99 at 405 nm. This ELISA procedure was used to evaluate the specificity of the four polyclonal antibodies to various lignocellulose degrading fungi in culture and in wood, Comparison oftwo ELISA techniques Two ELISA modifications were used. In the double antibody Sandwich ELISA, 96-welll microtitre plates (Dynatech.Labs,, 900 Slater's Lane, Alexandria, VA USA, Immulon 2, 0110103450) were coated with one of two antisera made either to cell wall fraction of Rplacenta or to extracellular filtrate (Goodell and Jellison 1986; Goodell et al. 1988). Coat concentrations ranged from 10 — 100 g/ ml and the plates were incubated at 37 °C for four hours and over- night at 4°C Samples of fungal ground in PBS at concentrations ranging from 1:1 to 1:1000 were the placed in duplicate wells in the plates at 200 /well to incubate overnight at 4°C.The plates were then rinsed and filled with the conjugated antisera which had been diluted from 1:200 to 1:500 in PBS-2% egg albumin. After incuba- tion for four hours at 37 °C the plates were rinsed to remove any unbound antisera and filled (200 /well) with the Substrate for the phosphatase enzyme p-nitrophenol phosphate PNPP (Sigma 104-105). Color development indicating the presence of the anti- gen was monitored at A 405  (yellow in color) with a microplatc col- orimeter. Holzforschung /Vol. 45 /1991 / No. 6 Copyright © 1991 Walter de Gruyter · Berlin · New York Brought to you by | University of Arizona Authenticated Download Date | 6/6/15 7:11 AM