13 7ª Jornada de Iniciação Científica - JINC 24 de outubro de 2013 Concórdia,SC COMPARAÇÃO DE MÉTODOS DE HOMOGENEIZAÇÃO CELULAR E CONGELAMENTO PARA EXTRAÇÃO DE RNA Bruna Petry¹*; Ricardo Zanella²; Adriana Mércia Guaratini Ibelli 3 ; Jorge Augusto Petroli Marchesi 4 ; José Rodrigo Claudio Pandolfi 5 ; Mônica Corrêa Ledur 5 e Jane de Oliveira Peixoto 5 ¹Graduanda em Ciências Biológicas, Universidade do Oeste de Santa Catarina, Campus de Joaçaba, Bolsista PIBIC/CNPq - Embrapa Suínos e Aves, e-mail: bruuna_petry@gmail.com ²Bolsista BJT/CNPq - Embrapa Suínos e Aves 3 Analista da Embrapa Suínos e Aves 4 Universidade do Contestado 5 Pesquisador da Embrapa Suínos e Aves Palavras-chave: RNA, extração de ácidos nucléicos, expressão gênica. INTRODUÇÃO A extração de DNA e RNA é uma das principais e mais importante etapas para a realização da maioria das metodologias utilizadas na biologia molecular. As amostras podem ser obtidas dos mais diversos tecidos e células e para que a extração possa ser feita, há uma infinidade de protocolos e reagentes que podem ser utilizados nesses procedimentos (2). Através de análises de RNA várias informações importantes sobre a expressão gênica e caracterização de transcritos podem ser obtidas, desde que o RNA seja extraído e purificado eficientemente, mantendo sua integridade e qualidade (1). Por isso, uma das maiores preocupações durante a extração do RNA é a sua degradação pela ação de ribonucleases (RNAses), que são enzimas altamente resistentes a diversos tratamentos, inclusive térmicos. Após a coleta, uma das etapas chave na extração de RNA é a maceração e lise dos tecidos ou células e as condições em que estes são submetidos (4). Dessa maneira, o objetivo deste trabalho foi comparar dois métodos de disrupção de tecidos, sob condições de resfriamento e congelamento, em amostras provenientes de ossos de aves. MATERIAL E MÉTODOS Amostras de ossos de galinha da população TT da Embrapa Suínos e Aves foram coletadas e imediatamente congeladas em nitrogênio líquido. Após, estas amostras foram mantidas em freezer -80ºC até o início dos testes. Aproximadamente 100 mg de tecido foram submetidos à quatro procedimentos de extração de RNA com Trizol (Invitrogen) (2). Nos protocolos 1 e 2, as amostras congeladas foram retiradas para extração e mantidas em nitrogênio líquido até a adição de Trizol. Nos protocolos 3 e 4 as amostras foram descongeladas e mantidas em gelo por aproximadamente 10 minutos até a adição do Trizol. Antes de iniciar a extração, as amostras dos protocolos 1 e 3 foram maceradas em almofariz de porcelana contendo nitrogênio líquido, enquanto que as dos protocolos 2 e 4 foram colocadas em Eppendorf 1,5mL contendo 1 mL de Trizol, esferas de aço inoxidável de 3.2 mm e colocadas no disputor de tecidos Bullet Blender, durante 5 minutos a velocidade 5. Após, a extração foi realizada com o protocolo padrão do Trizol (Invitrogen). A verificação da quantidade e pureza do RNA foi feita em espectrofotômetro Nanodrop e a qualidade foi verificada em gel de agarose 1% e em equipamento Bioanalyzer. A fim de verificar a influência do tipo de protocolo utilizado em estudos de PCR quantitativo, o cDNA das amostras dos 4 protocolos foi sintetizado a partir de 3 μg de RNA e então foram feitas reações de PCR em tempo real no equipamento 7500 SDS ( Applied Biosystems) para os genes constitutivos HPRT1, RPLP1, GAPDH, HBMS e RPL30. O Ct (threshold cycle) foi obtido e as variações entre os protocolos foram avaliadas. Foram considerados os melhores protocolos aqueles que obtiveram os menores Cts. RESULTADOS E DISCUSSÃO Como pode ser observado no gel de agarose 1% (Fig.1A), as amostras dos protocolos que permaneceram congeladas em nitrogênio líquido até a adição do Trizol (1 e 2) e do protocolo 3 que foi mantida em gelo e macerada em cadinho apresentaram as bandas de RNA ribossomal 28 e 18S nítidas, indicando que o RNA estava íntegro após as extrações. Já para o protocolo 4 mantido em gelo e homogeneizado em bullet blender, foi observada degradação parcial do RNA. Resultados semelhantes foram obtidos pela análise realizada em equipamento Bioanalyzer (Fig.1B), que utiliza eletroforese microfluídica e um algoritmo para verificação da qualidade do RNA (RIN). Nesta última análise, as amostras 1 e 3 apresentaram RIN maior que 8.0, indicando alta qualidade e integridade do RNA (Tabela 1). Em estudo semelhante, Carter et al. (2012) também observaram que ao usar amostras em temperatura próxima ao congelamento, o rendimento da extração do RNA era maior (3). Quando se brought to you by CORE View metadata, citation and similar papers at core.ac.uk provided by Repository Open Access to Scientific Information from Embrapa