An approach for the synthesis of duplexes containing N 3 T-butyl-N 3 T interstrand cross-links via a bisphosphoramidite strategy 1 Christopher James Wilds, Ernest Palus, and Anne Marietta Noronha Abstract: DNA duplexes containing an interstrand cross-link have been synthesized utilizing a bis-3 ′-O- phosphoramidite deoxythymidine dimer where the N 3 atoms are bridged by a butyl linker. With this approach sufficient quantities of high purity cross-linked duplexes are obtained that will enable various biochemical and structural studies to aid in research directed towards understanding the mechanism of interstrand cross-linked DNA repair. This method- ology has advantages over a previously reported method to synthesize cross-linked DNA duplexes involving a monophosphoramidite of the same cross-linked thymidine dimer including circumventing the use of costly 5 ′-O- deoxyphosphoramidites in the assembly of the cross-linked duplex by solid-phase synthesis. This strategy can be em- ployed to produce cross-linked duplexes in which the lesions are engineered to have a directly opposed (1–1) or stag- gered (1–2 or 2–1) orientations. Biophysical studies of duplexes containing this N 3 T-butyl-N 3 T cross-link in staggered 1–2 and 2–1 orientations reveal that both duplexes have a higher T m than a non-cross-linked duplex suggesting that these linkages do not result in the destabilization of duplex DNA. Circular dichroism spectra of the 1–2 and 2–1 cross- linked duplexes exhibit minor differences from B-form structure, which correlates with molecular modeling studies. Key words: chemically modified oligonucleotides, interstrand cross-link, DNA adduct, DNA repair. Résumé : Faisant appel à un dimère bis-3-O-phosphoramidite de désoxythymidine dans lequel les atomes en N 3 sont attachés par un lien butyle, on a réalisé la synthèse de duplex d’ADN contenant une réticulation entre brins. Avec cette approche, il a été possible d’obtenir des quantités suffisantes de duplex réticulés de grande pureté qui permettront de réaliser diverses études biochimiques et structurales qui aideront dans les études orientées vers la compréhension du mécanisme de réparation de l’ADN réticulée entre les brins. Pour la synthèse de duplex d’ADN réticulés impliquant un monophosphoramidite du même dimère de thymidine réticulée, cette méthodologie présente plusieurs avantages par rapport à une méthode proposée antérieurement, dont celui d’éviter dans l’assemblage du duplex réticulé par la syn- thèse en phase solide l’utilisation des 5’-O-désoxyphosphoramidites de coût élevé. Cette stratégie peut être utilisée pour produire des duplex réticulés dans lesquels les lésions sont construites de façon à présenter des orientations qui soient opposées (1–1) ou décalées (1–2 ou 2–1). Les études biophysiques des duplex contenant la réticulation N 3 T- butyl-N 3 T dans les orientations décalées 1–2 et 2–1 révèlent que ce deux duplex présentent du T m dont la valeur est su- périeure à celle du duplex non réticulé, ce qui suggère que ces liaisons ne résultent pas d’une déstabilisation du duplex de l’ADN. Les spectres de dichroïsme circulaire des duplex réticulés en 1–2 et en 2–1 présentent des différences mi- neures par rapport à celui de la structure de forme B, ce qui est en bon accord avec les études de modélisation molé- culaire. Mots-clés : oligonucléotides modifiés chimiquement, réticulation entre les brins, adduit d’ADN, réparation d’ADN. [Traduit par la Rédaction] Wilds et al. 256 Introduction The role that covalent DNA lesions play in cancer chemo- therapy needs no introduction. Interstrand cross-links (ICL) exert their therapeutic effect on cancer cells by preventing DNA strand separation and normal mitosis and ultimately lead to apoptosis, thus halting the process of cell prolifera- tion. However, the development of resistance to the effects of antitumor agents is often due to enhanced repair of interstrand cross-links (1–5). Although a number of repair pathways including homologous recombination and nucleo- tide excision repair have been implicated in cross-link repair in bacteria and mammalian cells (1), an understanding of the molecular mechanisms that are involved is lacking. Since development of resistance is one of the primary reasons for treatment failure, understanding how to alter the signaling of repair enzymes should allow chemotherapeutic agents to ef- fectively stop the spread of cancer cells. To correlate the structures of ICL and their repair, a num- ber of groups have focused on methods to produce larger Can. J. Chem. 85: 249–256 (2007) doi:10.1139/V07-015 © 2007 NRC Canada 249 Received 17 December 2006. Accepted 13 February 2007. Published on the NRC Research Press Web site at canjchem.nrc.ca on 27 March 2007. C.J. Wilds, 2 E. Palus, and A.M. Noronha. Department of Chemistry and Biochemistry, Concordia University, 7141 Sherbrooke St. West, Montréal, QC H4B 1R6, Canada. 1 This article is part of a Special Issue dedicated to Professor Kelvin K. Ogilvie. 2 Corresponding author (e-mail: cwilds@alcor.concordia.ca).