323 Braz. J. Vet. Res. Anim. Sci., São Paulo, v. 47, n. 4, p. 323-328, 2010 Introduction Bovine coronavirus (BCoV) is a member of the group 2 of the genus Coronavirus (Nidovirales: Coronaviridae) 1,2 , with a genome formed by single- stranded non-segmented positive-sense RNA with 32 kb, arranged in a nucleocapsid of helical symmetry in association with the N nucleoprotein, a conserved phosphoprotein with 50-60 kDa rich in basic amino- A semi-nested RT-PCR assay targeted to hemagglutinin- esterase gene of Bovine Coronavirus Reação de hemi-nested RT-PCR dirigida ao gene da hemaglutinina-esterase do Coronavírus Bovino Sibele Pinheiro de SOUZA 1,2 ; Karen Miyuki ASANO 1,2 ; Laura Yaneth Villarreal BUITRAGO 2,3 ; Sheila de Oliveira Souza SILVA 1,2 ; Leonardo José RICHTZENHAIN 1,2 ; Paulo Eduardo BRANDÃO 1,2 1 Departament of Preventive Veterinary and Animal Health, School of Veterinary Medicine, University of São Paulo, São Paulo-SP, Brazil 2 Coronavirus Research Group, FMVZ-USP, São Paulo-SP, Brazil 3 Intervet - Schering Plough Animal Health Correspondence to: Sibele Pinheiro de Souza Av. Prof. Dr. Orlando Marques de Paiva 87, Cidade Universitária, São Paulo, SP 05508 270, Brazil e-mail: sibele.souza@gmail.com Received: 24/04/2009 Approved: 04/03/2010 Abstract Bovine coronavirus (BCoV) is a non-segmented positive-sense single-stranded RNA virus whose envelope is constituted by a lipid bilayer with four structural proteins (HE, S, E and M) giving its characteristic crown-like virions appearance. Hemagglutinin-esterase (HE), is a polymorphic protein with a function of secondary receptor binder, and studies on the diversity of HE gene allow insights on BCoV evolution and host-parasite interactions. A semi-nested RT-PCR was developed for the amplifcation of a 441bp-long product of the HE gene of BCoV (nt 543 to 562). Optimal annealing temperatures were tested in a gradient thermocycler for the semi-nested assay and employed in the fnal protocol. Te analytical sensitivity was determined by 10-fold serial dilutions of the BCoV Kakegawa strain (HA titer: 256) in a BCoV-free fecal suspension, with positive results up to 10 -6 dilution, a high analytical sensitivity without PCR inhibition. Te fnal semi-nested RT-PCR protocol was applied to 21 fecal samples of cows previously positive to BCoV and DNA sequencing of the 441bp amplicons of 14 of these resulted in highly-scored BCoV HE gene sequences afer BLAST/n analysis. Tis semi-nested RT-PCR is a powerful tool for surveys of phylogenetic diversity in feld strains of BCoV and for comparative studies among diferent genes of Coronavirus. Keywords: Bovine coronavirus. RT-PCR. Hemagglutinin-esterase. Genetic diversity. Resumo O coronavírus bovino (BCoV) é um vírus RNA simples fta, de sentido positivo, não segmentado com envelope constituído de uma camada dupla de lipídios com quatro proteínas (HE, S, E e M) que resultam no aspecto de coroa dos vírions. Como a HE (hemaglutinina-esterase) é uma proteína polimórfca com uma função de receptor aglutinante secundária, estudos sobre a diversidade do gene HE podem possibilitar maiores informações sobre a evolução e interação hospedeiro-parasita do BCoV. Uma reação de hemi-nested RT-PCR foi desenvolvida para a amplifcação de um produto de 441pb do gene HE do BCoV (nt 543 ao 562). Temperaturas ótimas de hibridização foram testadas em um termociclador com gradiente para a reação de hemi-nested e utilizada no protocolo fnal. A sensibilidade analítica foi determinada por meio da diluição serial na base 10 do BCoV amostra Kakegawa (título HA: 256) em uma suspensão fecal negativa para BCoV, resultando positiva até a diluição de 10 -6 , mostrando uma alta sensibilidade analítica sem inibição na PCR. O protocolo fnal da hemi-nested RT-PCR foi aplicado a 21 amostras fecais de vacas previamente positivas para BCoV e o sequenciamento de DNA do produto de 441pb de 14 amostras resultaram em sequências com elevado escore do gene HE do BCoV após a análise no BLAST/n. Essa hemi-nested RT-PCR é uma ferramenta poderosa para estudos de diversidade flogenética de linhagens de campo de BCoV e para estudos comparativos entre os diferentes genes dos Coronavírus. Palavras-chave: Coronavírus bovino. RT-PCR. Hemaglutinina-esterase. Diversidade genética.