D O S S I E R T E C H N I Q U E 1405 Les techniques de cytogénétique moléculaire : principes et progrès Nouha Bouayed Abdelmoula, Marie-France Portnoï, François Vialard, Ahlem Amouri, Jacqueline Van den Akker, Jean-Louis Taillemite L es premières techniques d’hybridation in situ sur chro- mosomes datent de 1969 lorsque Gall et Pardue ont utilisé un ARN ribosomique radioactif pour détecter la présence de gènes d’ADN ribosomique sur des chromosomes d’amphibiens [1]. Plus tard, Saunder, en 1972 [2] et Jones en 1973 [3] utilisèrent des sondes radioactives complémentaires de l’ADN satellite pour hybrider les régions centromériques des chromo- somes métaphasiques. L’hybridation in situ sur chromosomes d’une séquence d’ADN non répétée et radioactive a été réalisée, pour la pre- mière fois par Harper et Saunder [4] ainsi que par Gerhard [5] en 1981, grâce à l’adjonction d’une macromo- lécule, le sulfate de dextran, dans le milieu d’hybridation. L’hybridation in situ s’est ensuite développée grâce au clonage de l’ADN à l’aide de vecteurs plasmi- diques qui a permis de produire de grandes quantités d’ADN et des sondes de meilleure qualité. Toute- fois, l’utilisation de nucléotides radioactifs et de méthodes d’autora- diographie pour marquer et révéler les sondes a limité le champ d’appli- cation de l’hybridation in situ. Le véritable essor de la cytogénétique moléculaire date des années 1986- 1988 avec l’utilisation de sondes dites froides non radioactives et le déve- loppement de l’hybridation in situ en fluorescence (FISH) [6] par les équipes de Pinkel [7, 8] et de Cre- mer [9]. Depuis, de grands progrès techniques en cytogénétique molécu- laire ont été réalisés et mis à profit aussi bien dans la recherche en géné- tique que dans le diagnostic clinique. Technique rapide et simple d’analyse chromosomique, l’hybridation in situ en fluorescence a conduit à intro- duire la biologie moléculaire dans l’arsenal des techniques d’analyse cytogénétique dont le caryotype reste toutefois l’examen de première intention. Elle a contribué à l’augmentation de la spécificité et du pouvoir de résolu- tion (c’est-à-dire la capacité de distin- guer un segment chromosomique d’un segment contigu). En effet, avec la cytogénétique classique, le seg- ment unitaire détectable est consti- tué par la plus petite bande indivi- dualisable après marquage des chromosomes, ce qui correspond à 10 6 -10 7 paires de bases (pb), et ce sur des chromosomes en prométaphase sur lesquels on peut définir 800 à 1 000 bandes contiguës par génome haploïde. En cytogénétique molécu- laire, le pouvoir de résolution peut varier – selon différentes approches qu’on abordera plus loin – de 1 mégabase (Mb) jusqu’à quelques kilobases (kb). Cela dépend en partie de l’état de condensation de la chro- matine. Une interprétation de plus en plus fine est rendue possible grâce à de nombreuses avancées technologiques réalisées dans ce domaine, telles que la possibilité d’hybrider simultané- ment plusieurs sondes d’ADN mar- quées différemment, l’existence d’un panel de plus en plus large de sondes spécifiques et, enfin, le développe- ment d’outils informatiques et numé- riques de plus en plus puissants. Ces derniers permettent de capter les signaux fluorescents avec des camé- ras vidéos à haute résolution et de les transformer en images digitalisées manipulables sur analyseur d’images afin d’obtenir une meilleure résolu- tion et une augmentation du rapport signal/bruit de fond. La technique d’hybridation in situ en fluorescence a aussi rendu possible l’exploration des cellules au stade interphasique du cycle cellulaire, augmentant ainsi le nombre de cel- m/s n° 12, vol. 16, décembre 2000 DOSSIER médecine/sciences 2000 ; 16 : 1405-11 La cytogénétique moléculaire est une nouvelle approche morphologique qui utilise à la fois les outils de la biologie moléculaire et de la cytogénétique. La principale technique utilisée actuellement est l’hybridation in situ fluorescente (FISH) qui consiste en l’hybridation de sondes froides d’ADN sur des lames de préparations cytogénétiques de cellules métaphasiques ou interphasiques et sa révélation par fluorescence. Initialement utilisée pour localiser certaines séquences répétées de l’ADN sur des chromosomes métaphasiques, son champ d’application s’est progressivement diversifié. Elle constitue actuellement un outil puissant et performant dans l’établissement de la carte du génome humain, l’analyse des processus tumoraux et le diagnostic chromosomique prénatal et post-natal. TECHNIQUE