5-Hydroxymethylcytosin DOI: 10.1002/ange.201002033 Quantitative Bestimmung der sechsten DNA-Base Hydroxy- methylcytosin im Gehirn** Martin Münzel, Daniel Globisch, Tobias Brückl, Mirko Wagner, Veronika Welzmiller, Stylianos Michalakis, Markus Müller, Martin Biel und Thomas Carell* Der genetische Code wird durch die Sequenz der vier kano- nischen DNA-Nucleoside dA, dC, dG und dT bestimmt. [1] In Zellen höherer Organismen wird von diesen nur dC chemisch modifiziert, um die Transkriptionsaktivität zu kontrollieren. [2] Spezifische Methyltransferasen ersetzen das H-Atom an Po- sition 5 von dC durch eine Methylgruppe, wodurch Methyl- cytosin ( 5-Me dC) gebildet wird. [3] Diese Methylierung tritt nur in CpG-Sequenzen auf und ist hauptsächlich für die epige- netische Stummschaltung von Genen verantwortlich. [4] Kürzlich wurde in zwei Publikationen Hydroxymethylcytosin ( 5-HOMe dC) als weitere postreplikative DNA-Modifikation vorgestellt (Schema 1). Kriaucionis und Heintz entdeckten 5-HOMe dC in Purkinje-Neuronen des Kleinhirns. [5] Tahiliani et al. berichteten von Spuren von 5-HOMe dC (ca. 0.032 % aller Nucleoside) in embryonalen Stammzellen von Mäusen and konnten das neue Nucleosid auch in HEK-Zellen (HEK: human embryonic kidney) detektieren, wenn sie dort das hydroxylierende 2-Oxoglutarat- und Eisen(II)-abhängige Enzym TET1 überexprimierten. [6] Zusätzlich konnten die Forscher zeigen, dass die TET-Enzymfamilie die 5-Methyl- gruppe von 5-Me dC in vitro hydroxylieren kann. Zur Detektion des neuen DNA-Nucleosids wurde Dünnschichtchromato- graphie mit radioaktiv markierten Nucleotiden verwendet. Die Funktion von 5-HOMe dC ist momentan unbekannt, aber es wird spekuliert, dass es ein weiteres Instrument zur Tran- skriptionskontrolle oder ein Intermediat eines möglichen oxidativen Demethylierungsmechanismus darstellt. [7] Wir haben eine quantitative LC-MS-Methode entwickelt, um die Verteilung von 5-HOMe dC im Säugetiergehirn zu un- tersuchen und die relativen Mengen von 5-HOMe dC und 5-Me dC zu bestimmen. Zu diesem Zweck haben wir beide Nucleoside in natürlicher und isotopenmarkierter Form synthetisiert [8] (Schema 2) und ihre Menge in verschiedenen Bereichen des Gehirns von Mäusen untersucht. Schema 1. Struktur der vier kanonischen Nucleoside und der postrepli- kativen Modifikationen 5-Me dC und 5-HOMe dC. Schema 2. Synthese der natürlichen und isotopenmarkierten Nucleo- side 5-HOMe dC, [ 18 O] 5-HOMe dC, 5-Me dC und [D 3 ] 5-Me dC. a) H 2 O, DIPEA, 72 %; b) TBSCl, Imidazol, 46 %; c) NaH, TPSCl; d) NH 3 /MeOH, 76 % über zwei Stufen; e) 3 HF·NEt 3 , 52%; f) NaH, TPSCl; g) NH 3 /MeOH, 81 % über zwei Stufen; h) HF·pyr, 88%; i) CD 3 MgI, CuCl, [Pd(PPh 3 ) 4 ], 90 % untrennbares Gemisch aus 6 und TBSdC; j) HF·pyr, 84%(basie- rend auf 6).[ 18 O] 5-HOMe dC wurde analog zu 5-HOMe dC synthetisiert. Der Stern zeigt die Position der 18 O-Markierung an. DIPEA: N,N-Di- isopropylethylamin, pyr: Pyridin, TBS: tert-Butyldimethylsilyl, TPS: 2,4,6-Triisopropylbenzolsulfonyl. [*] Dipl.-Chem. M. Münzel, [+] Dipl.-Chem. D. Globisch, [+] Dipl.-Chem. T. Brückl, Dipl.-Chem. M. Wagner, Dipl.-Chem. V. Welzmiller, Dr. M. Müller, Prof.Dr. T. Carell Center for Integrated Protein Science (CiPS M ) am Department Chemie, Ludwig-Maximilians-Universität Butenandtstraße 5–13, 81377 München (Deutschland) E-Mail: thomas.carell@cup.uni-muenchen.de Dr. S. Michalakis, Prof. Dr. M. Biel Center for Integrated Protein Science (CiPS M ) am Department Pharmazie, Ludwig-Maximilians-Universität München [ + ] Diese Autoren haben zu gleichen Teilen zu dieser Arbeit beigetra- gen. [**] Wir danken dem Exzellenzcluster CiPS M , SFB 646 und SFB 749 für großzügige Unterstützung. M. Münzel dankt dem Fonds der Che- mischen Industrie für ein KekulØ-Stipendium. Wir danken V. Ham- melmann für ihre Hilfe. Hintergrundinformationen zu diesem Beitrag sind im WWW unter http://dx.doi.org/10.1002/ange.201002033 zu finden. Angewandte Chemie 5503 Angew. Chem. 2010, 122, 5503 –5505  2010 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim