Cell Transplantation, Vol. 6, No. 2, pp. 149-162, 1997  Copyright © 1997 Elsevier Science Inc.  Printed in the USA. All rights reserved  0963-6897/97 $17.00 + .00  ELSEVIER S0963-6897(96)00142-X  Original Contribution TRANSPLANTATION OF RETINAL PIGMENT EPITHELIUM USING VIABLE  CRYOPRESERVED CELLS  YUSUF K. DURLU 1  AND MAKOTO TAMAI  Department of Ophthalmology, Tohoku University School of Medicine, 1-1 Seiryo-machi, Aoba-ku, Sendai, Miyagi 980-77, Japan  • Abstract — Transplantation of retinal pigment epithe- lium (RPE) may have potential clinical application for the  surgical treatment of RPE-specific retinal degeneration, in- cluding age-related macular degeneration. The feasibility of  an RPE storage bank has been investigated by experiment- ing with transplantation using viable, cryopreserved RPE  cells. Fresh and cultured fetal human and bovine RPE cells  were cryopreserved in 90% fetal bovine serum containing  10% dimethyl sulfoxide. The viability of the cells before and  after cryopreservation was evaluated by trypan blue dye  exclusion test, microculture tetrazolium assay (MTA), tis- sue culture, and transplantation after cryopreservation.  The origin of RPE cells before and after cryopreservation  was assessed by immunocytochemistry, immunoblotting,  and indirect ELISA of RPE-marker protein using cytoker- atin for cultured fetal human RPE cells and by immunocy- tochemistry of cellular retinaldehyde-binding protein (CR- ALBP) for cultured bovine RPE cells. Freshly isolated and  cryopreserved uncultured bovine RPE cells were trans- planted by posterior transscleral approach into the subreti- nal spaces of adult albino rabbits and 23-day-old Royal  College of Surgeons (RCS) rats with a 33 gauge Hamilton  syringe. Following surgery, artificial retinal blebs were con- firmed by fundus examination. Morphologic examination  was performed postoperatively by light and electron mi- croscopy in albino rabbits and by light microscopy in RCS  rats up to 3 mo. Control subretinal injections using vehicle  solution also were performed in RCS rats. Cultured fetal  human and bovine RPE cells after cryopreservation were  found to be viable, based on the results of trypan blue dye  exclusion test, MTA, tissue culture, and transplantation.  Expression and reexpression of cytokeratin intermediate  filaments in cultured fetal human RPE were demonstrated  by immunocytochemistry, immunoblotting, and indirect  ELISA before and after cryopreservation. Immunocyto- chemistry of CRALBP before and after cryopreservation in  uncultured bovine RPE cells disclosed expression and re- expression of RPE cell marker protein. No uncultured fetal  human RPE cells showed proliferation in tissue culture af- ter cryopreservation. In rabbits, light and electron micros- copy disclosed xenografted RPE cells residing on Bruch's  membrane of the host retina. No sign of graft vs. host re- action was observed. No morphologic difference was noted  between the fresh and 10-day-old cryopreserved RPE cells  in situ following transplantation at day 25. In RCS rats,  subretinal injection of 3-wk-old cryopreserved bovine RPE  cells partially rescued photoreceptor cells locally at the  transplanted area observed at 3 mo postoperatively. The  retinal photoreceptors at the inferior hemisphere of the  transplanted eye and the eye injected with vehicle solution  showed no rescue effect. We found that cryopreserved cul- tured fetal human RPE cells and uncultured and cultured  bovine RPE cells can be used for RPE transplantation stud- ies. The ability to create an RPE storage bank as a source  of donor cells may result in several clinical advantages.  © 1997 Elsevier Science Inc.  • Keywords — Cryopreservation; Immunocytochemistry;  Retinal pigment epithelium; Xenotransplantation.  INTRODUCTION  The vital properties of the neural retina for vision are  maintained by the physical (barrier), optical (absorption  of light), metabolic/biochemical (phagocytosis and vita- min A metabolism), developmental/trophic support, and  transport (ion, amino acids, and vitamin A) functions of  the retinal pigment epithelium (RPE) (19). Several clini- cal and experimental studies have indicated that RPE- specific functional defects result in the degeneration of  photoreceptors (4,11,18,37).  ACCEPTED 5/15/96.  Presented in part at 33rd North Japan Eye Congress (Akita),  July 7, 1995 and annual (1996) meeting of the Association for  Research in Vision and Ophthalmology, Fort Lauderdale,  Florida.  'Correspondence should be addressed to Dr.Yusuf K. Durlu,  Department of Ophthalmology, Tohoku University School of  Medicine, 1-1 Seiryo-machi, Aoba-ku, Sendai, Miyagi 980-77,  Japan.  149